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08 TCR/BCR 测序分析

T 细胞受体（TCR）和 B 细胞受体（BCR）单细胞测序把免疫学里最核心的问题——"同一个细胞是哪个克隆"——放到了分辨率最高的层面。10x Genomics 的 V(D)J 试剂盒能同时测出一个细胞的 GEX（基因表达）和 V(D)J（受体序列），后续分析的主线就是：把 V(D)J 结果和 GEX 对象绑起来，再在每个聚类里看克隆是否扩增、扩增来自哪些通路。

本节介绍两种最常见的做法：用 Seurat 把 clonotype 作为 metadata 加进对象（适合快速可视化），以及用 scRepertoire 做更完整的克隆分析（适合多样本比较）。

这种数据能回答的核心问题​

V(D)J 测序解决一个 RNA-seq 不能回答的问题：两个 T 细胞看上去几乎一样（同样的 CD3+CD4+ memory marker），但它们识别的抗原可能完全不同。

具体场景：

  • 抗原识别追踪：肿瘤里的 T 细胞中，哪些是真在打肿瘤、哪些是路过的旁观者？看克隆扩增 — 扩增的更可能是抗原特异性
  • 疫苗 / 治疗响应：免疫治疗后，新出现的扩增克隆有哪些？克隆是从哪个亚群里冒出来的？
  • 克隆与功能状态绑定：同一个克隆的细胞是分散在 effector / memory / 耗竭多个状态，还是集中在某一个？这告诉你这个克隆的命运

适合做 V(D)J 的项目：肿瘤免疫、感染响应、自免、疫苗。不适合：发育图谱、稳态健康成人 PBMC（克隆多样性高、扩增稀少，跑了也没什么发现）。

V(D)J 数据的基本概念​

术语说明
V / D / J可变区的三段基因片段，重组组合决定了受体多样性
CDR3受体上最变异的区域，是克隆身份的"指纹"
Clonotype基于 CDR3 序列等定义的一组相同来源细胞
Clonal expansion某个 clonotype 在样本中出现多次（抗原驱动）

TCR 由 α 链和 β 链组成，通常 β 链更能代表克隆身份；BCR 由重链和轻链组成，重链负责识别。

Cell Ranger 的 VDJ 流程​

GEX 和 VDJ 来自同一样本的不同文库。Cell Ranger 的 VDJ 子命令会输出 contigs、clonotypes 和每个细胞的注释：

cellranger vdj \
  --id=sample_tcr \
  --reference=refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-7.0.0 \
  --fastqs=/path/to/fastqs \
  --sample=sample_name

运行完会得到 outs/filtered_contig_annotations.csv，每行是一个 contig，带 barcode、chain（TRA/TRB）、v/d/j_gene、CDR3 序列和 raw_clonotype_id。

用 Seurat 把 clonotype 当 metadata 加进来​

这是最简单的做法：把 VDJ 表聚合到 barcode 级，作为 metadata 加到 GEX 的 Seurat 对象上，就能在 UMAP 上按 clonotype 染色。

library(Seurat)
library(dplyr)

# 先有一个已分析好的 GEX Seurat 对象（03 / 04 章的产物）
gex <- readRDS("pbmc_gex.rds")

# 读取 Cell Ranger VDJ 的 contig annotation
tcr <- read.csv("filtered_contig_annotations.csv")

# 把每个 barcode 聚合成一行，保留 clonotype 和 CDR3
clonotypes <- tcr %>%
  group_by(barcode) %>%
  summarise(
    clonotype_id = first(raw_clonotype_id),
    cdr3         = paste(unique(cdr3), collapse = ";")
  ) %>%
  tibble::column_to_rownames("barcode")

# 加到 Seurat metadata（只会加到匹配得上 barcode 的细胞）
gex <- AddMetaData(gex, metadata = clonotypes)

# 在 UMAP 上看前 10 个最大的 clonotype
top_clones <- head(sort(table(gex$clonotype_id), decreasing = TRUE), 10)
gex$top_clone <- ifelse(gex$clonotype_id %in% names(top_clones),
                        gex$clonotype_id, NA)
DimPlot(gex, group.by = "top_clone", order = TRUE)

这样就能直观看到"扩增最多的克隆落在哪些聚类"。但这种做法只是展示，还不能做克隆多样性、克隆追踪之类的定量分析。

用 scRepertoire 做完整克隆分析​

scRepertoire 把常见克隆分析打包成一套函数，多样本场景下尤其方便：

library(scRepertoire)

# 载入多个样本的 VDJ 结果
tcr_list <- list(
  sample1 = read.csv("sample1/filtered_contig_annotations.csv"),
  sample2 = read.csv("sample2/filtered_contig_annotations.csv")
)

# 合并并标注样本来源
combined <- combineTCR(
  tcr_list,
  samples = c("S1", "S2"),
  ID      = c("P1", "P1")
)

# 克隆多样性（样本间对比）
clonalDiversity(combined, cloneCall = "gene")

# 克隆稳态：按克隆占比划档看分布
clonalHomeostasis(combined, cloneCall = "gene")

# 把 repertoire 信息合并进 Seurat GEX 对象
gex <- combineExpression(combined, gex,
                         cloneCall = "gene",
                         proportion = TRUE)

combineExpression 会在 gex@meta.data 里新增 cloneType 等字段，标记每个细胞属于"单拷贝/小克隆/中克隆/大克隆"。再配合 DimPlot(gex, group.by = "cloneType") 就能看到克隆扩增在 UMAP 空间的分布。

BCR 的流程几乎完全一致，只是用 combineBCR 代替 combineTCR。

真实示例：8 个样本跑一遍 scRepertoire​

配套脚本 module09_tcr_sci.R 用 scRepertoire 包自带的 8 个 10x VDJ 样本（4 个病人 P17~P20 各自 B/L 两个部位，contig_list）和配套的 500 细胞 Seurat 对象（scRep_example）演示完整流程。包里的数据是真实样本的 filtered_contig_annotations，不需要下载。

Rscript scripts/single-cell/sc09_tcr_sci.R

脚本的顺序是：combineTCR 合并 8 个样本 → 算各样本独立克隆数、丰度分布、稳态、Shannon 多样性、样本两两之间的 Morisita 重叠 → combineExpression 把克隆信息写进 Seurat 的 metadata，在 UMAP 上按克隆大小上色。

每张图看什么​

各样本的独立克隆数

图 1：每个样本的独特克隆数除以该样本的 T 细胞总数。scale=TRUE 去掉样本大小差异，数值越低说明克隆集中度越高。可以直接看到 P19L、P20B 这种组织/淋巴样本比外周血样本更"少而大"。

克隆丰度分布

图 2：克隆按频率排序，纵轴是该频率上的克隆数。曲线长尾越平、越往右延伸说明"有少数克隆扩增得特别大"；曲线集中在左下角说明所有克隆都很小、差异不明显。

克隆稳态

图 3：把每个样本的克隆按大小分成 Rare / Small / Medium / Large / Hyperexpanded 五档，画堆叠条形。Hyperexpanded 占比越高说明样本里有显著抗原驱动扩增。这是比较治疗前后、组织间免疫反应强度最直观的一张图。

Shannon 多样性

图 4：每个样本的 Shannon 多样性指数。Shannon 越低代表克隆被少数几个大克隆主导。真实项目里，除了 Shannon，还会一起画 inv.simpson、chao1，但 scRepertoire 2.x 的 clonalDiversity 一次只画一个指标，要多画几张。

样本两两之间的克隆重叠

图 5：样本两两之间用 Morisita 指数衡量共享克隆的热图。越接近 1 说明两个样本里大小靠前的克隆越一致。可以看到同一个病人不同部位（P17B-P17L、P19B-P19L）之间的共享明显高于跨病人。

UMAP 上的克隆扩增分布

图 6：把上面算出的 cloneSize 档位写到 Seurat 的 metadata 里，直接在 UMAP 上按档位染色。每个点是一个 T 细胞，灰色=几乎没扩增，红/紫色=超大克隆。连 GEX 聚类一起看，就能回答"哪些亚群里扎堆出现了扩增克隆"。

套到自己数据上​

脚本里的 combineTCR 直接换成自己 read.csv("filtered_contig_annotations.csv") 结果的 list，samples 和 tissue_ids 换成自己的样本/部位标签即可。scRep_example 那步换成自己已经走过 03~04 章标准流程的 Seurat 对象；combineExpression 的 cloneSize 档位按样本规模调，样本很小时把最大档降到 0.05 以下能避免上不了色。BCR 的流程几乎完全一样，把 combineTCR 换成 combineBCR 即可。

常见分析方向​

  • 抗原特异性定位：拿扩增 top 克隆的 CDR3，和 VDJdb、IEDB 等公共数据库里已知抗原特异性的 CDR3 比对，推测它们识别什么。
  • 克隆与细胞状态关联：看扩增 clonotype 落在哪些聚类（耗竭 T？效应 T？），结合差异基因解释功能状态。
  • 治疗前后追踪：配对样本里同一个克隆在前后的频率、亚群归属变化，是免疫治疗响应研究的主线。

常见坑​

坑 1：GEX 和 VDJ 的 barcode 来自不同 library​

10x V(D)J 试剂盒里 GEX 和 TCR / BCR 是两份独立的 library（不同 sequencing run）。barcode 是同一套，但 fastq 是分开下机的。读 contig csv 后 AddMetaData 时只匹配 barcode 重叠那部分细胞 — 没有 TCR 信息的细胞 metadata 列是 NA，这是正常的。

坑 2：把所有 contig 都当独立克隆​

一个 T 细胞可能有 2 条 α + 1 条 β（双 TCR）或 1 条 α + 1 条 β。直接用 contig 数当克隆数会错，要用 raw_clonotype_id 这个汇总后的 ID。scRepertoire::combineTCR 会处理双链问题，比手动聚合可靠。

坑 3：稀有克隆的统计意义​

样本里出现 1 次的克隆叫 singleton — 不能说"这个克隆没扩增"。它可能是真的稀有，也可能是这个克隆的其他成员没被采到。用 clonalDiversity 看整体多样性，而不是去解读单个 singleton。

坑 4：跨样本比较不做样本大小校正​

P19L 5000 个细胞 vs P17B 500 个细胞，直接比克隆数 P19L 一定多。要用 clonalQuant(scale = TRUE) 或归一化到每千细胞克隆数后比较，否则结论是"细胞多的样本克隆多"这种空话。

坑 5：BCR 数据不做 hypermutation 分析就当 TCR 用​

BCR 在抗原刺激下会发生 somatic hypermutation，同一克隆的不同细胞 CDR3 序列也会有差异。如果用 TCR 那套"完全相同 CDR3 = 同克隆"判定，BCR 会把同一克隆的不同子代算成不同克隆。BCR 项目用 combineBCR + scoper 做克隆型聚类，不要直接用 raw_clonotype_id。

下载资源​

module09_tcr_sci.R12 KB

下载 scRepertoire 8 样本 TCR 完整脚本

下一步​

接着深入：

横向延伸：

参考资源​

AI 组学实践

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AI 会读这篇文章后给你 3-5 步学习计划， 逐步带你学完，最后出 1-3 道题验证你掌握得怎么样。 登录后 AI 才能记住你的进度。

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