09 空间转录组学
空间转录组在 scRNA-seq 的基础上保留了一个关键维度：每条表达信号来自切片的哪个位置。不同技术的空间分辨率差别很大：10x Visium 把组织打在微珠芯片上，每个 spot 约 55 μm 包含数个细胞；Slide-seq、MERFISH、seqFISH+ 能做到单细胞或亚细胞分辨率，代价是数据量更大、分析工具更专。
本节用 10x Visium 小鼠脑数据演示最常用的一条流程：读入 → 质控 → 空间感知标准化（SCT）→ 聚类 → 空间变异基因 → 与参考 scRNA-seq 数据做 cell type 反卷积。
主流空间技术对比
| 技术 | 分辨率 | 数据量 | 常用工具 |
|---|---|---|---|
| 10x Visium | spot（~55 μm） | 中等 | Seurat、Scanpy + Squidpy |
| Slide-seq V2 | ~10 μm | 中等 | Seurat、RCTD |
| Stereo-seq | 亚微米 | 大 | StereoPy |
| MERFISH / seqFISH+ | 单细胞 | 大 | Squidpy、Giotto |
| Xenium | 亚细胞 | 大 | 10x pipeline、Seurat |
Visium 仍然是门槛最低的选择：一张切片产出的 spot 数在几千级，普通笔记本能直接分析，教材、社区工具链也最完整。
用 Seurat 分析 Visium 小鼠脑
从 10x Genomics 下载 Visium 小鼠脑切片数据后（或用 SeuratData 里的 stxBrain），基本流程和 scRNA-seq 很像，只是多了 spatial 这一层坐标和组织图片：
library(Seurat)
# 若要一键获取示例数据：
# InstallData("stxBrain")
# brain <- LoadData("stxBrain", type = "anterior1")
# 或者从本地目录读取
brain <- Load10X_Spatial(
data.dir = "~/biof3-data/visium-mouse-brain/outs",
filename = "filtered_feature_bc_matrix.h5",
assay = "Spatial",
slice = "slice1"
)
# 质控：在组织图上看每个 spot 的总表达量
VlnPlot(brain, features = "nCount_Spatial", pt.size = 0.1) + NoLegend()
SpatialFeaturePlot(brain, features = "nCount_Spatial")
两张 QC 图放一起看：有没有"测序偏低的区域"集中在切片边缘（组织脱落），或者局部 异常高（气泡、污染）。
标准化这一步建议用 SCTransform，它对 spot 间差异较大的空间数据表现稳定：
brain <- SCTransform(brain, assay = "Spatial", verbose = FALSE)
brain <- RunPCA(brain, assay = "SCT")
brain <- FindNeighbors(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)
brain <- FindClusters(brain, verbose = FALSE)
brain <- RunUMAP(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)
# 聚类结果同时画在 UMAP 和组织切片上
DimPlot(brain, label = TRUE)
SpatialDimPlot(brain, label = TRUE, label.size = 3)
小鼠脑 Visium 在 SpatialDimPlot 里会呈现皮层、海马、胼胝体等解剖结构对应的聚类，不做任何 cell type 注释也能看出大致分区。
空间变异基因
常规的 FindVariableFeatures 只考虑表达变异，不考虑位置。空间变异基因是"表达分布不是随机的"，通常也是真正有解剖学意义的基因：
brain <- FindSpatiallyVariableFeatures(
brain,
assay = "SCT",
features = VariableFeatures(brain)[1:1000],
selection.method = "moransi"
)
top_features <- head(
SpatiallyVariableFeatures(brain, selection.method = "moransi"),
6
)
SpatialFeaturePlot(brain, features = top_features, ncol = 3, alpha = c(0.1, 1))
"moransi"（Moran's I）衡量的是邻近 spot 的表达相似度，值越高说明越空间聚集。alpha 是作图参数，用来突出高表达区域、弱化背景。
真实示例：Visium 小鼠脑 Anterior 切片
配套脚本 module10_spatial_sci.R 用 SeuratData::stxBrain 的 anterior1 切片（10x Visium 小鼠脑前部，约 2700 个 spot）把上面的流程跑完。首次运行会通过 InstallData("stxBrain") 把数据装到本地（~136 MB），之后每次复用不再下载。
Rscript scripts/single-cell/sc10_spatial_sci.R
脚本顺序：LoadData 加载 Seurat 对象 → 在组织图上画 QC → SCTransform 标准化 → PCA / Leiden 聚类 / UMAP → 在 UMAP 和切片上各看一遍 cluster → 画四个已知解剖学 marker 的空间表达 → 用 Moran's I 找空间变异基因 → 单基因在 UMAP 和切片上的同步视图。
每张图看什么
图 1：左图是每个 spot 的总 UMI 数（测序深度），右图是检测到的基因数。切片边缘深度偏低是正常的（组织少），内部如果出现一块局部异常高的亮斑就要警惕气泡、折叠或污染。这一步直接看切片比看小提琴图更直观。
图 2：SCT 归一化后在 PCA 上跑 Leiden 得到的聚类，投到 UMAP 上。和 scRNA-seq 不同，Visium 的 cluster 数量不会太多（10 几个），因为一个 spot 代表的是几个细胞的混合。
图 3：同一个 seurat_clusters 直接画到组织切片上。不用做任何 cell type 注释，已经能看到皮层（同心环层）、海马（马蹄形）、胼胝体（中央带状）、脉络丛（点状）自然对应上不同的 cluster。这是 Visium 最"震撼"的一张图：空间聚类 = 解剖学结构。
图 4：四个经典小鼠脑 marker 的空间表达 —— Hpca（海马）、Ttr（脉络丛）、Mbp（胼胝体 / 白质）、Cux2（皮层 II/III 层）。把这张图和图 3 一起看，能验证上一步的聚类是否确实落到了对应的解剖结构上。真实项目里换上自己关心的基因就能直接读出组织定位。
图 5：用 Moran's I 在前 1000 个高变基因里排名，取 Top 6 画空间分布。脚本实际跑出来是 Ttr, Hbb-bs, Mbp, Plp1, Hba-a1, Ptgds —— 脉络丛、红细胞、胼胝体、少突胶质、红细胞、脑膜/神经干细胞 —— 每一个都对应清晰的解剖结构，而不是随机散布，这正是空间变异基因要挑的信号。
图 6：把 Mbp 在 UMAP 和组织切片上各画一张放一起。左边看它对应 UMAP 里的哪一个 cluster，右边看它对应切片上的什么结构。当一个未知基因的 UMAP 分布集中但你又不知道它的生物学意义时，拿它跟切片版一起看，经常能马上定位到"这是 XX 层 / XX 核团的 marker"。
套到自己数据上
脚本对小鼠脑做了演示。自己的切片（人脑、肿瘤、肝、皮肤等）换 LoadData 那行为 Load10X_Spatial("~/path/to/outs")，其余不动就行。marker_genes 按组织换：比如做肿瘤切片，可以换成 EPCAM（上皮）、PTPRC（免疫）、COL1A1（基质）；做肝切片可以换成 ALB（肝细胞）、GLUL（周中静脉）、CYP2E1（三区带）。分辨率更高的技术（Stereo-seq、Xenium）数据量更大，配合 Python 的 Squidpy 更流畅。
把 scRNA-seq 当作参考做反卷积
Visium 的每个 spot 通常包含多个细胞，直接做 cell type 注释会模糊。常用做法是把已经注释好的 scRNA-seq 数据当参考，把 spot 内的细胞组成估出来。常用工具有 RCTD、SPOTlight、CARD：
# SPOTlight 示例（输入：scRNA 参考 + Visium 对象）
library(SPOTlight)
sc_ref <- readRDS("pbmc_reference.rds") # 假设已分析并注释
markers <- Seurat::FindAllMarkers(sc_ref)
spotlight_res <- SPOTlight(
x = sc_ref,
y = brain,
groups = sc_ref$cell_type,
mgs = markers
)
plotSpatialScatterpie(
x = brain,
y = spotlight_res,
cell_types = unique(sc_ref$cell_type),
img = FALSE
)
得到的 scatterpie 在每个 spot 位置画一个小饼图，显示各 cell type 的估计比例。常见验证方式：查看某种 cell type 的比例在组织切片上是否和已知解剖学位置一致。
用 Scanpy + Squidpy 做 Python 版
Python 生态下 scanpy 配合 squidpy 可以覆盖类似流程，并提供更丰富的空间统计（nhood enrichment、co-occurrence 等）：
import scanpy as sc
import squidpy as sq
adata = sc.read_visium("~/biof3-data/visium-mouse-brain/outs")
adata.var_names_make_unique()
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, inplace=True)
sc.pl.spatial(adata, color="total_counts")
sc.pp.normalize_total(adata, inplace=True)
sc.pp.log1p(adata)
sc.pp.highly_variable_genes(adata, flavor="seurat", n_top_genes=2000)
sc.pp.pca(adata)
sc.pp.neighbors(adata)
sc.tl.umap(adata)
sc.tl.leiden(adata)
sc.pl.spatial(adata, color="leiden")
# 空间邻域富集：看哪些 cluster 在空间上彼此相邻
sq.gr.spatial_neighbors(adata)
sq.gr.nhood_enrichment(adata, cluster_key="leiden")
sq.pl.nhood_enrichment(adata, cluster_key="leiden")
Scanpy/Squidpy 侧最适合的场景是高分辨率空间数据（Stereo-seq、MERFISH），它们对大矩阵更友好。Visium 级别数据两套都能跑，选择看个人生态。
下载资源
参考资源
离线资料下载
手册 HTML / PDF 已在后台预生成，点击后直接下载网站静态资源。