09 空间转录组学

空间转录组在 scRNA-seq 的基础上保留了一个关键维度：每条表达信号来自切片的哪个位置。不同技术的空间分辨率差别很大：10x Visium 把组织打在微珠芯片上，每个 spot 约 55 μm 包含数个细胞；Slide-seq、MERFISH、seqFISH+ 能做到单细胞或亚细胞分辨率，代价是数据量更大、分析工具更专。

本节用 10x Visium 小鼠脑数据演示最常用的一条流程：读入 → 质控 → 空间感知标准化（SCT）→ 聚类 → 空间变异基因 → 与参考 scRNA-seq 数据做 cell type 反卷积。

空间数据 vs 单细胞数据：换的是什么

很多新手把空间数据当作"加了坐标的单细胞"。这是错的，会带来三个直接后果：

维度	scRNA-seq	Visium
一个观测单元	1 个细胞	1 个 spot ≈ 1-10 个细胞混合
细胞类型注释	直接给 cluster 命名	要做反卷积估比例，单一 cell type 标签会误导
差异分析	比较两群细胞	比较两个空间区域，要考虑组织结构混杂
主问题	"这是什么细胞"	"这块组织在干什么"

Visium 的核心价值是空间结构，不是细胞分辨率。如果只想做精细的 cell type 分型，scRNA-seq 更合适；想问"哪些区域的免疫浸润强"、"肿瘤边界在分泌什么"、"白质和灰质的界面是什么"，才轮到空间技术。

更高分辨率技术（Xenium、MERFISH）在单细胞分辨率，但牺牲了通量（可测的基因数 200-1000 个，远少于 Visium 的全转录组）。没有"分辨率高、通量也高"的免费午餐，先想清楚问题再选技术。

主流空间技术对比

技术	分辨率	数据量	常用工具
10x Visium	spot（~55 μm）	中等	Seurat、Scanpy + Squidpy
Slide-seq V2	~10 μm	中等	Seurat、RCTD
Stereo-seq	亚微米	大	StereoPy
MERFISH / seqFISH+	单细胞	大	Squidpy、Giotto
Xenium	亚细胞	大	10x pipeline、Seurat

Visium 仍然是门槛最低的选择：一张切片产出的 spot 数在几千级，普通笔记本能直接分析，教材、社区工具链也最完整。

用 Seurat 分析 Visium 小鼠脑

从 10x Genomics 下载 Visium 小鼠脑切片数据后（或用 SeuratData 里的 stxBrain），基本流程和 scRNA-seq 很像，只是多了 spatial 这一层坐标和组织图片：

library(Seurat)
# 若要一键获取示例数据：
# InstallData("stxBrain")
# brain <- LoadData("stxBrain", type = "anterior1")

# 或者从本地目录读取
brain <- Load10X_Spatial(
  data.dir = "~/biof3-data/visium-mouse-brain/outs",
  filename = "filtered_feature_bc_matrix.h5",
  assay    = "Spatial",
  slice    = "slice1"
)

# 质控：在组织图上看每个 spot 的总表达量
VlnPlot(brain, features = "nCount_Spatial", pt.size = 0.1) + NoLegend()
SpatialFeaturePlot(brain, features = "nCount_Spatial")

两张 QC 图放一起看：有没有"测序偏低的区域"集中在切片边缘（组织脱落），或者局部异常高（气泡、污染）。

标准化这一步建议用 SCTransform，它对 spot 间差异较大的空间数据表现稳定：

brain <- SCTransform(brain, assay = "Spatial", verbose = FALSE)
brain <- RunPCA(brain, assay = "SCT")
brain <- FindNeighbors(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)
brain <- FindClusters(brain, verbose = FALSE)
brain <- RunUMAP(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)

# 聚类结果同时画在 UMAP 和组织切片上
DimPlot(brain, label = TRUE)
SpatialDimPlot(brain, label = TRUE, label.size = 3)

小鼠脑 Visium 在 SpatialDimPlot 里会呈现皮层、海马、胼胝体等解剖结构对应的聚类，不做任何 cell type 注释也能看出大致分区。

空间变异基因

常规的 FindVariableFeatures 只考虑表达变异，不考虑位置。空间变异基因是"表达分布不是随机的"，通常也是真正有解剖学意义的基因：

brain <- FindSpatiallyVariableFeatures(
  brain,
  assay              = "SCT",
  features           = VariableFeatures(brain)[1:1000],
  selection.method   = "moransi"
)

top_features <- head(
  SpatiallyVariableFeatures(brain, selection.method = "moransi"),
  6
)
SpatialFeaturePlot(brain, features = top_features, ncol = 3, alpha = c(0.1, 1))

"moransi"（Moran's I）衡量的是邻近 spot 的表达相似度，值越高说明越空间聚集。alpha 是作图参数，用来突出高表达区域、弱化背景。

真实示例：Visium 小鼠脑 Anterior 切片

配套脚本 module10_spatial_sci.R 用 SeuratData::stxBrain 的 anterior1 切片（10x Visium 小鼠脑前部，约 2700 个 spot）把上面的流程跑完。首次运行会通过 InstallData("stxBrain") 把数据装到本地（~136 MB），之后每次复用不再下载。

Rscript scripts/single-cell/sc10_spatial_sci.R

脚本顺序：LoadData 加载 Seurat 对象 → 在组织图上画 QC → SCTransform 标准化 → PCA / Leiden 聚类 / UMAP → 在 UMAP 和切片上各看一遍 cluster → 画四个已知解剖学 marker 的空间表达 → 用 Moran's I 找空间变异基因 → 单基因在 UMAP 和切片上的同步视图。

每张图看什么

图 1：左图是每个 spot 的总 UMI 数（测序深度），右图是检测到的基因数。切片边缘深度偏低是正常的（组织少），内部如果出现一块局部异常高的亮斑就要警惕气泡、折叠或污染。这一步直接看切片比看小提琴图更直观。

图 2：SCT 归一化后在 PCA 上跑 Leiden 得到的聚类，投到 UMAP 上。和 scRNA-seq 不同，Visium 的 cluster 数量不会太多（10 几个），因为一个 spot 代表的是几个细胞的混合。

图 3：同一个 seurat_clusters 直接画到组织切片上。不用做任何 cell type 注释，已经能看到皮层（同心环层）、海马（马蹄形）、胼胝体（中央带状）、脉络丛（点状）自然对应上不同的 cluster。这是 Visium 最"震撼"的一张图：空间聚类 = 解剖学结构。

图 4：四个经典小鼠脑 marker 的空间表达 —— Hpca（海马）、Ttr（脉络丛）、Mbp（胼胝体 / 白质）、Cux2（皮层 II/III 层）。把这张图和图 3 一起看，能验证上一步的聚类是否确实落到了对应的解剖结构上。真实项目里换上自己关心的基因就能直接读出组织定位。

图 5：用 Moran's I 在前 1000 个高变基因里排名，取 Top 6 画空间分布。脚本实际跑出来是 Ttr, Hbb-bs, Mbp, Plp1, Hba-a1, Ptgds —— 脉络丛、红细胞、胼胝体、少突胶质、红细胞、脑膜/神经干细胞 —— 每一个都对应清晰的解剖结构，而不是随机散布，这正是空间变异基因要挑的信号。

图 6：把 Mbp 在 UMAP 和组织切片上各画一张放一起。左边看它对应 UMAP 里的哪一个 cluster，右边看它对应切片上的什么结构。当一个未知基因的 UMAP 分布集中但你又不知道它的生物学意义时，拿它跟切片版一起看，经常能马上定位到"这是 XX 层 / XX 核团的 marker"。

套到自己数据上

脚本对小鼠脑做了演示。自己的切片（人脑、肿瘤、肝、皮肤等）换 LoadData 那行为 Load10X_Spatial("~/path/to/outs")，其余不动就行。marker_genes 按组织换：比如做肿瘤切片，可以换成 EPCAM（上皮）、PTPRC（免疫）、COL1A1（基质）；做肝切片可以换成 ALB（肝细胞）、GLUL（周中静脉）、CYP2E1（三区带）。分辨率更高的技术（Stereo-seq、Xenium）数据量更大，配合 Python 的 Squidpy 更流畅。

把 scRNA-seq 当作参考做反卷积

Visium 的每个 spot 通常包含多个细胞，直接做 cell type 注释会模糊。常用做法是把已经注释好的 scRNA-seq 数据当参考，把 spot 内的细胞组成估出来。常用工具有 RCTD、SPOTlight、CARD：

# SPOTlight 示例（输入：scRNA 参考 + Visium 对象）
library(SPOTlight)

sc_ref <- readRDS("pbmc_reference.rds")   # 假设已分析并注释
markers <- Seurat::FindAllMarkers(sc_ref)

spotlight_res <- SPOTlight(
  x      = sc_ref,
  y      = brain,
  groups = sc_ref$cell_type,
  mgs    = markers
)

plotSpatialScatterpie(
  x          = brain,
  y          = spotlight_res,
  cell_types = unique(sc_ref$cell_type),
  img        = FALSE
)

得到的 scatterpie 在每个 spot 位置画一个小饼图，显示各 cell type 的估计比例。常见验证方式：查看某种 cell type 的比例在组织切片上是否和已知解剖学位置一致。

用 Scanpy + Squidpy 做 Python 版

Python 生态下 scanpy 配合 squidpy 可以覆盖类似流程，并提供更丰富的空间统计（nhood enrichment、co-occurrence 等）：

import scanpy as sc
import squidpy as sq

adata = sc.read_visium("~/biof3-data/visium-mouse-brain/outs")
adata.var_names_make_unique()

sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, inplace=True)
sc.pl.spatial(adata, color="total_counts")

sc.pp.normalize_total(adata, inplace=True)
sc.pp.log1p(adata)
sc.pp.highly_variable_genes(adata, flavor="seurat", n_top_genes=2000)

sc.pp.pca(adata)
sc.pp.neighbors(adata)
sc.tl.umap(adata)
sc.tl.leiden(adata)
sc.pl.spatial(adata, color="leiden")

# 空间邻域富集：看哪些 cluster 在空间上彼此相邻
sq.gr.spatial_neighbors(adata)
sq.gr.nhood_enrichment(adata, cluster_key="leiden")
sq.pl.nhood_enrichment(adata, cluster_key="leiden")

Scanpy/Squidpy 侧最适合的场景是高分辨率空间数据（Stereo-seq、MERFISH），它们对大矩阵更友好。Visium 级别数据两套都能跑，选择看个人生态。

常见坑

坑 1：只下了 filtered_feature_bc_matrix，没下 spatial 文件夹

Visium 的"空间"信息（图片 + spot 坐标）放在 spatial/ 子目录，不在表达矩阵 tar 包里。下载时要同时下 _spatial.tar.gz，否则 Load10X_Spatial 会报错或画不出切片图。这个坑在 01 章 PBMC 部分已经提过，做空间项目时再重提一次。

坑 2：用 scRNA-seq 那套阈值过滤 spot

nFeature_RNA < 200 在单细胞合理，但 spot 是几个细胞的混合，正常 spot 通常 > 1000 个基因。组织薄、深度低的边缘 spot 可能 < 500，但要看是组织本身就稀疏（脑的白质区域基因表达本来就少）还是切片缺陷。先 SpatialFeaturePlot 看分布，再定阈值，不要直接套单细胞经验值。

坑 3：把 Visium spot 当单细胞做差异表达

每个 spot 是 1-10 个细胞的混合，spot 间差异 = 细胞类型组成差异 + 表达差异混在一起。直接 FindMarkers 出来的差异基因没法解释成"该细胞类型上调了 X" — 可能只是这个区域多了某类细胞。需要先做反卷积估比例，再做基于比例的统计建模。

坑 4：Moran's I 选高变基因后跑，把组织背景都筛掉了

FindSpatiallyVariableFeatures 默认只在前 1000 个高变基因里搜，有些有解剖学意义的基因（脑里的 Mbp、Plp1）虽然空间高度聚集但不是 top 高变基因，会被漏掉。要么扩大候选范围（features = VariableFeatures(brain)[1:5000]），要么直接用全基因，代价是慢一些。

坑 5：反卷积参考集和 Visium 数据物种 / 状态不匹配

用人 PBMC scRNA-seq 当参考，去反卷积小鼠脑 Visium — 直接错。反卷积参考集必须和目标数据物种一致、组织来源接近。理想情况是同实验室同批次做的 scRNA-seq 当参考，至少也要是同物种同组织的公开数据。

在线分析：不想配环境，直接在 BioF3 跑

上面这套流程要本地装 Seurat / Squidpy / 反卷积包，对新手不友好。BioF3 把空间转录组的核心分析做成了云平台 + 在线工具两条线，浏览器里就能跑，后端用 scanpy + Squidpy（Python 生态，空间分析比 R 更全）。

空间组学云平台（/spatial）

空间组学云平台 和单细胞云平台操作习惯完全一致：新建项目 → 上传 .h5ad 数据集 → 选分析类型 → 看结果 + AI 解读。适合要管理多个项目 / 多次分析串起来的场景。当前支持 5 类分析：标准流程、重聚类、空间高变基因、细胞解卷积、配体受体。

上传要求：.h5ad（AnnData）含 obsm['spatial'] 坐标。10x Visium 标准输出直接可用。

在线工具（/tools，单次分析不建项目）

如果只想跑一次、不想建项目，用 /tools 下的空间组学工具，上传文件一键出 SCI 报告：

工具	对应本章内容	入口
空间转录组标准分析	QC → 聚类 → UMAP → 邻域富集 → SVG（本章主线流程）	/tools/#spatial-standard
空间高变基因（SVG）	Moran's I + Geary's C + Sepal 三方法共识（比本章单一 Moran's I 更稳）	/tools/#spatial-svg
空间细胞解卷积	Tangram 把单细胞参考映射到 spot（对应本章反卷积小节）	/tools/#spatial-deconv
空间配体受体	LIANA 空间感知 LR（本章没展开，是空间通讯的进阶玩法）	/tools/#spatial-lr

每个工具都带真实 Visium 小鼠脑公开 demo（进工具页点"报告"按钮即可看），不上传也能先看效果。

想自己改图？ 这些工具的输出图都能在 FigCode 找到对应卡片（spatial-cluster / feature-spatial / spatial-svg-moran / spatial-deconv-c2l / spatial-lr-liana / squidpy-neighbors），复制代码改配色 / 改基因即可。

下载资源

module10_spatial_sci.R12 KB

↓

下载 Visium 小鼠脑空间分析完整脚本

下一步

接着深入：

• 10 scATAC-seq 分析 — 单细胞专题的最后一篇，染色质层面的分析
• 06 细胞-细胞通讯分析 — 在空间数据上做通讯分析比 scRNA-seq 可靠得多，因为能直接验证 sender 和 receiver 的物理距离

横向延伸：

• 03 质量控制、聚类与细胞类型注释 — 反卷积参考集就是用 03 章流程注释好的 scRNA-seq 数据
• Squidpy 文档 — Python 端做空间统计（邻域富集、共定位）的标准工具

参考资源

• 10x Visium 官方文档
• Seurat Spatial Vignette
• Squidpy 文档
• SPOTlight
• Giotto Suite