07 多模态数据分析
多模态单细胞技术在一个细胞里同时测两种信息：CITE-seq 同时测 RNA 和细胞表面蛋白，10x Multiome 同时测 RNA 和染色质可及性。相比纯 scRNA-seq，多模态数据的优势是可以相互验证和补充：RNA 层的聚类结果，往往能在蛋白层找到更清晰的 marker。
本节用 10x Genomics 的 5k PBMC CITE-seq 数据演示最常用的一条 CITE-seq 分析流程：分别标准化 RNA 和 ADT，再用 WNN（Weighted Nearest Neighbor）做联合聚类。
蛋白层为什么值得多花一份钱
直接的问题：既然 RNA 已经能聚类、能注释，为什么还要测蛋白？
| 维度 | 仅 RNA | RNA + ADT |
|---|---|---|
| 稀疏度 | dropout 严重，CD4 / CD8 等 marker 在 1/3 细胞读不到 | ADT 信号稳定连续，无 dropout |
| mRNA vs 蛋白 | 表达的不一定翻译，翻译的不一定上膜 | 蛋白才是真正"行使功能"的分子 |
| 流式可比性 | 流式做的是蛋白 → 不能直接对比 | 蛋白信号 = 流式信号，能跨技术验证 |
| 稀有亚群 | 几十个细胞的群体 marker 信号被噪声淹没 | ADT 信噪比高，几十个细胞也能定义 |
所以 CITE-seq 不是"加个蛋白看看"。它在三个具体场景里值钱：
- 免疫细胞精细分型（naive vs memory T、不同 monocyte 亚群）
- 稀有亚群定义（regulatory T、γδ T、tissue-resident memory 这种几十-几百个细胞的群体）
- 跨技术验证（同一项目里有流式 / IHC 数据时，ADT 是桥梁）
如果你的目标是大类细胞分型 + 整体差异基因，RNA 单独够用，没必要花两倍钱。
多模态技术对比
| 技术 | 测量内容 | 常见用途 |
|---|---|---|
| CITE-seq | RNA + 表面蛋白（ADT） | 免疫学、细胞分型 |
| ASAP-seq | RNA + 染色质开放 | 调控机制 |
| 10x Multiome | RNA + ATAC（同细胞） | 基因表达与调控联动 |
| Perturb-seq | RNA + CRISPR 扰动 | 遗传学筛选 |
CITE-seq 门槛低，直接用标准 Seurat/Scanpy 就能做；Multiome 需要走 Cell Ranger ARC 流程，后续分析借助 Signac 或 MultiVI。
CITE-seq 的 WNN 分析
数据是 01 章里介绍过的 5k PBMC CITE-seq，下载后 filtered_feature_bc_matrix/ 目录里同时包含 Gene Expression 和 Antibody Capture 两层矩阵。
先读入并分别对两层数据做标准化和降维：
library(Seurat)
# 读取 CITE-seq 数据（同时包含 RNA 和 ADT）
data_dir <- "~/biof3-data/pbmc5k-citeseq/filtered_feature_bc_matrix"
counts <- Read10X(data.dir = data_dir)
# 创建 Seurat 对象：RNA 作为主 assay，ADT 作为额外 assay
cbmc <- CreateSeuratObject(counts = counts$`Gene Expression`, project = "PBMC5K_CITE")
cbmc[["ADT"]] <- CreateAssayObject(counts = counts$`Antibody Capture`)
# RNA 标准化 + 高变基因 + PCA
DefaultAssay(cbmc) <- "RNA"
cbmc <- NormalizeData(cbmc)
cbmc <- FindVariableFeatures(cbmc)
cbmc <- ScaleData(cbmc)
cbmc <- RunPCA(cbmc)
# ADT 用 CLR 归一化（Centered Log Ratio），更适合抗体信号
DefaultAssay(cbmc) <- "ADT"
cbmc <- NormalizeData(cbmc, normalization.method = "CLR", margin = 2)
cbmc <- ScaleData(cbmc)
cbmc <- RunPCA(cbmc, reduction.name = "apca")
RNA 和 ADT 的归一化方式不同：RNA 常用 LogNormalize，ADT 用 CLR（margin = 2 意为按细胞做 CLR）。两层分别做完 PCA 后，用 WNN 把它们的邻居结构加权合并，再在合并图上聚类和降维：
# WNN：根据两个 reduction 同时找邻居
cbmc <- FindMultiModalNeighbors(
cbmc,
reduction.list = list("pca", "apca"),
dims.list = list(1:30, 1:18)
)
# 在 WNN 图上做 UMAP 和聚类
cbmc <- RunUMAP(cbmc, nn.name = "weighted.nn", reduction.name = "wnn.umap")
cbmc <- FindClusters(cbmc, graph.name = "wsnn", resolution = 0.5)
# 可视化
DimPlot(cbmc, reduction = "wnn.umap", label = TRUE)
跑完得到的 cbmc@meta.data 里会新增一列 seurat_clusters，Reductions(cbmc) 里会多出 wnn.umap。比较三张 UMAP（只用 RNA、只用 ADT、WNN 联合）通常会看到：WNN 版本在分群边界上更干净，尤其是 T 细胞内部的 CD4/CD8 亚群。
真实示例：5k PBMC CITE-seq 走 WNN
配套脚本 module08_cite_seq_sci.R 把上面的流程完整跑了一遍，用的是 10x 官方 5k PBMC CITE-seq 数据（Gene Expression + 32 个抗体的 TotalSeq-B panel，~37 MB）：
Rscript scripts/single-cell/sc08_citeseq_sci.R
脚本顺序跟上一节完全对上：Read10X 自动拆出两层矩阵 → 分别建 RNA 和 ADT assay → RNA 做 LogNormalize + PCA、ADT 做 CLR + PCA → FindMultiModalNeighbors 合并两个 reduction → 在 WNN 图上做 Leiden 聚类和 wnn.umap，同时单独留一份 rna.umap 和 adt.umap 用来对比。QC 之后大概留下 4000 多个细胞。
每张图看什么
图 1：把同一份 WNN 聚类标签分别画到 RNA UMAP、ADT UMAP 和 WNN UMAP 上。RNA UMAP 在小群细胞（DC、浆细胞样）上分得更细，ADT UMAP 对 T/B/单核大类的边界更干净，WNN 结合两边的优势，最终的 cluster 边界最整齐。
图 2：每个细胞在 WNN 邻居图里 RNA 的权重。接近 1 的区域主要靠 RNA 区分（像稀有亚群、发育状态相关的细胞），接近 0 的区域主要靠 ADT 区分（像成熟 T 细胞、单核细胞）。这张图是"WNN 不是简单平均"的最直观证据。
图 3：CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD56 六个经典 marker 的 ADT 信号在 WNN UMAP 上的分布。CD3⁺ 的大块就是 T 细胞，其内部 CD4 和 CD8 分得很干净；CD19⁺ 对应 B 细胞；CD14⁺ 对应单核；CD56⁺ 对应 NK。不需要再额外做 marker 查询，这六张子图就能把 PBMC 的主要群体读出来。
图 4：同一 WNN UMAP 上 CD3D（RNA 层）和 CD3-TotalSeqB（ADT 层）的表达对比。RNA 信号稀疏、有不少落在 T 细胞区的细胞读数为 0；ADT 信号连续、集中，边界非常锐利。这是 CITE-seq 最直接的价值：抗体信号稳定得多，做 T/非 T 的切分不会因为 dropout 误伤。
图 5：ADT panel 前 20 个抗体在每个 cluster 里的平均表达（颜色）和阳性细胞比例（点大小）。每个 cluster 对应的阳性抗体组合一看就懂：CD3/CD4/CD45RA 是 naive CD4 T，CD3/CD8/CD45RO 是 memory CD8 T，CD14/CD11b 是经典单核，CD19/CD20 是 B，依此类推。真实项目里直接看这张图就能把大部分 cluster 命名掉。
图 6：WNN UMAP 加聚类标签的完整视图。这张和单独做 RNA-only 的 UMAP 放在一起看差别最大：某些在 RNA 里贴得很近的群体（比如 CD4 memory 和 CD4 naive、CD8 effector 和 CD8 central memory）在 WNN 里通过 CD45RA/CD45RO 和 CD62L 的蛋白信号区分出来了。
套到自己数据上
脚本对 ADT 抗体名做了宽松匹配（^CD3[-_] 同时兼容 CD3_TotalSeqB 和 CD3-TotalSeqB 两种写法）。自己的 panel 只要还是 CD3/CD4/CD8/CD14/CD19/CD56 这类常规抗体名，直接跑通图 3 和图 4 的概率很高。panel 完全不同（比如肿瘤免疫的 checkpoint panel）的话，把 adt_markers 里的 CD 改成自己关心的抗体即可。nfeatures、dims.list、resolution 这三个参数按样本量调，其余不用动。
后续可做的分析
- 按蛋白 marker 重新注释聚类：PBMC 的 ADT panel 一般包含 CD3/CD4/CD8/CD19/CD14 等经典标志，比起光靠 RNA 标记，注释会更可靠。
- 找差异蛋白：
FindMarkers(cbmc, assay = "ADT", ...)可以直接在 ADT 层做差异分析。 - 与原章节对比：把这份数据的 WNN 聚类结果和 04 章里只做 RNA 的整合结果画到一起，能看到蛋白信号如何修正 RNA-only 的分群。
10x Multiome（RNA + ATAC）分析思路类似，但 ATAC 层要用 Signac，归一化方法是 TF-IDF + SVD，后面在 10 scATAC-seq 分析 里会再讲。
常见坑
坑 1：用 LogNormalize 处理 ADT
ADT counts 的尺度和 RNA 完全不同（背景噪声更高、动态范围更小），用 RNA 那套 LogNormalize 会把 ADT 信号压扁。ADT 一定用 CLR（normalization.method = "CLR", margin = 2）。
坑 2：WNN 之后忘了切回想分析的 assay
WNN 整合 后想做差异蛋白分析，得 DefaultAssay(obj) <- "ADT"；想画 RNA 热图，得切 "RNA"。忘记切就会用错 assay 跑分析。
坑 3：ADT panel 的抗体名匹配不上
不同 panel / 不同试剂版本，抗体在 metadata 里的名字写法五花八门：CD3-TotalSeqB、CD3_TotalSeqB、anti-human-CD3。画图前先 rownames(obj[["ADT"]]) 看一遍，再用 grep 匹配。
坑 4：Read10X 没识别出多 modality
Read10X 自动拆分依赖 features.tsv.gz 第 3 列的 Gene Expression / Antibody Capture 标签。自己拼接数据时如果第 3 列写错或丢了，Read10X 不会拆，全都进 RNA assay。读完检查 class(counts)：是 list 才对，是单矩阵就有问题。
坑 5：用 ADT 信号做 cluster，再用 cluster 找差异蛋白
这是循环验证。用蛋白聚类，再说"该 cluster 蛋白 X 高表达" — 当然高，因为它本来就是因 X 高而被聚到一起的。WNN 用两个模态联合聚类才能避免这个问题；只用 ADT 聚类的话，差异蛋白结论需要外部数据验证。
下载资源
不想本地装环境？在 BioF3 上跑细胞通讯
下一步
接着深入：
- 10 scATAC-seq 分析 — 10x Multiome 把 RNA + ATAC 同时测在同一细胞，思路和 CITE-seq 一致但 ATAC 那一层有自己的归一化（TF-IDF）
- 08 TCR/BCR 测序分析 — 把克隆型作为第三维度加进 RNA + ADT 框架，免疫学项目的标配
横向延伸：
- 04 多样本数据整合 — 多模态数据的多样本整合更复杂，需要考虑 RNA 和 ADT 各自的批次
- Seurat WNN 教程 — WNN 算法的原始介绍
参考资源
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