04 分析路线设计：先用便宜的看大方向
探索完数据确认质量没问题之后，很多人的下一步是"把所有能做的分析全跑一遍"。这是效率最低的做法 — 跑完一周发现 80% 的结果用不上，剩下 20% 还需要重跑。
正确的做法是：先用最便宜（最快、最简单）的分析确认信号存在，再决定往哪个方向深入。
"便宜"和"贵"的分析
| 分析 | 时间成本 | 信息量 | 什么时候做 |
|---|---|---|---|
| PCA + 临床变量相关 | 5 分钟 | 整体方向 | 最先 |
| 简单 DESeq2（tumor vs normal） | 10 分钟 | 差异信号强度 | 确认数据能用 |
| 单变量 Cox（top DE 基因） | 15 分钟 | 预后信号是否存在 | 确认选题可行 |
| LASSO Cox 建 signature | 1-2 小时 | 核心结果 | 主线分析 |
| CIBERSORT 免疫浸润 | 30 分钟 | 免疫微环境 | 主线分析 |
| 外部队列验证 | 2-3 小时 | 结果可靠性 | 主线完成后 |
| WGCNA 模块分析 | 3-4 小时 | 共表达网络 | 补充分析 |
| 单细胞反卷积 | 半天 | 细胞组成 | 锦上添花 |
原则：从上往下做，每一步的结果决定下一步要不要做。
TCGA-LIHC 的快速筛选
我们的选题是"免疫相关基因 + 预后 + 浸润"。在正式跑 LASSO 之前，先花 30 分钟确认三件事：
确认 1：tumor vs normal 差异信号存在
# 快速 DESeq2（不做 shrinkage，只看 summary）
dds <- DESeqDataSet(se, design = ~ sample_type)
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds)
summary(res)
# 如果 padj < 0.05 的基因 > 3000 个，信号很强，可以继续
TCGA-LIHC 的 tumor vs normal 差异非常明显（几千个 DE 基因），这一步基本不会失败。
确认 2：免疫基因里有预后信号
# 从 ImmPort 或 MSigDB 拿免疫相关基因列表（约 2000 个）
immune_genes <- readLines("data/immune_gene_list.txt")
# 对每个免疫基因做单变量 Cox
library(survival)
cox_results <- lapply(immune_genes, function(g) {
expr <- assay(vsd)[g, ]
group <- ifelse(expr > median(expr), "high", "low")
fit <- coxph(Surv(OS.time, OS) ~ group, data = clin)
data.frame(gene = g, HR = exp(coef(fit)), p = summary(fit)$coefficients[5])
})
cox_df <- bind_rows(cox_results)
sum(cox_df$p < 0.05)
# 如果 > 100 个免疫基因和 OS 显著相关，信号够做 signature
确认 3：免疫浸润评分和分期相关
# 用 ESTIMATE 快速算免疫评分（比 CIBERSORT 快 10 倍）
library(estimate)
# ... 算出 ImmuneScore
kruskal.test(ImmuneScore ~ stage, data = clin)
# p < 0.05 说明免疫浸润和分期有关，值得深入
三个确认都通过 → 正式开始主线分析。任何一个不通过 → 回头调整选题方向。
主线分析路线图
确认信号存在后，画一张路线图：
Step 1: DESeq2 差异分析（tumor vs normal）
↓ 取显著 DE 基因 ∩ 免疫基因列表
Step 2: LASSO Cox 筛选 prognostic signature
↓ 得到 N 个基因的 risk score 公式
Step 3: KM 生存验证（TCGA 内部 train/test split）
↓ 确认 signature 能分预后
Step 4: 外部验证（ICGC-LIRI）
↓ 确认不是过拟合
Step 5: CIBERSORT 免疫浸润 vs risk score
↓ 解释 signature 的生物学意义
Step 6: 临床亚组分析 + 多变量 Cox
↓ 确认 signature 独立于分期/年龄
每一步预计时间：Step 1-2 半天，Step 3-4 半天，Step 5-6 半天。总计 1.5-2 天跑完主线。
时间预算的经验法则
一个完整的组学项目（从数据到投稿）的时间分配：
| 阶段 | 占比 | 说明 |
|---|---|---|
| 选题 + 文献 | 15% | 想清楚比跑快更重要 |
| 数据获取 + 探索 | 15% | 本专栏 01-03 章 |
| 主线分析 | 30% | 本专栏 04-05 章 |
| 验证 + 补充 | 20% | 本专栏 06 章 |
| 写作 + 图表 | 20% | 本专栏 07-10 章 |
新手最常见的时间分配错误：把 80% 时间花在"跑分析"上，写作只留 2 天。结果图表粗糙、Discussion 空洞、Methods 缺版本号。
常见坑
坑 1：跳过快速筛选直接做 LASSO
LASSO Cox 跑 1-2 小时，如果免疫基因里根本没有预后信号，这 2 小时白费。先花 15 分钟做单变量 Cox 扫一遍，确认有信号再上 LASSO。
坑 2：所有分析都用全部样本
LASSO 建模和验证不能用同一批样本。一开始就把 TCGA 样本 7:3 split 成 train/test，train 上建模、test 上验证。不 split 的结果审稿人不认。
坑 3：路线图没有"停止条件"
"如果外部验证 AUC < 0.6 怎么办？" — 要提前想好。每一步都设一个"不通过就回头"的标准，避免沉没成本陷阱。
坑 4：补充分析做太多
WGCNA + 单细胞反卷积 + 药物敏感性 + ceRNA 网络 — 全做完要两周，但审稿人可能只看主线。补充分析最多做 2 个，选和主线最相关的。
坑 5：不记录分析决策
"为什么用 LASSO 不用 Random Forest？" "为什么阈值选 0.05 不选 0.01？" — 这些决策写论文时要解释。每做一个选择就在 README 里记一行，不然三个月后自己也忘了。
下一步
接着深入：
- 05 主线分析：跑通最重要那一条 — 按路线图执行 Step 1-6
横向延伸：
- bulk RNA-seq 02 DESeq2 — Step 1 的 详细教程
- bulk RNA-seq 05 多时间点与 LRT — 如果你的设计比两组比较更复杂
参考资源
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