BioF3 团队

AI 会告诉你"三个工具结果相似，选哪个都行"。但不会告诉你重叠到底多少、不重叠的基因有什么特征、什么情况下该选哪个。这篇用 4 份真实 RNA-seq 数据集跑了三个工具，给你具体数字。

为什么"随便选一个"是不够的​

DESeq2、edgeR、limma-voom 是 bulk RNA-seq 差异分析三大工具。AI 回答"怎么选"时几乎都说"结果高度一致，看个人偏好"。这话不算错，但有三件事 AI 说不清：

1. "高度一致"到底是多少？ 80% 重叠还是 95%？差的那 5-20% 是什么基因？
2. 什么情况下不一致会放大？ 样本数少？测序深度低？多因子设计？
3. 三个工具的假设和模型差异对实际结果有什么影响？

实测设计​

4 份真实公开 RNA-seq 数据集：

每个数据集用相同预处理（STAR 比对 + featureCounts 计数 + 相同 QC），分别跑：

• DESeq2：DESeqDataSet → DESeq → results，padj < 0.05, |log2FC| > 1
• edgeR：DGEList → calcNormFactors → estimateDisp → exactTest / glmQLFTest，FDR < 0.05, |log2FC| > 1
• limma-voom：voom → lmFit → eBayes，adj.P.Val < 0.05, |log2FC| > 1

核心结果​

差异基因数量​

关键发现：重叠在 75-80%，不是"95% 高度一致"。每份数据有 20-25% 的基因只被 1-2 个工具检出。

不重叠的基因有什么特征​

把基因按"三者都检出" vs "只有一个工具检出" 分两组比较：

结论：不重叠的主要是低表达 + 高离散度 + 边界 fold change 的基因。这些基因本身就不稳定，不同模型对它们的处理方式不同：

• DESeq2 的 shrinkage 会把它们拉向 0 → 不显著
• edgeR 对高离散度基因更敏感 → 更容易检出
• limma-voom 的 voom 权重对低 count 基因降权 → 保守

什么时候结果差异会放大​

实操建议​

1. 入门 / 小样本（<5/组）→ DESeq2：离散度估计最稳健，文档最完善
2. 大样本（>20/组）→ edgeR：速度快，glmQLFTest 适合复杂设计
3. 多因子 / 复杂设计矩阵 → limma-voom：design = model.matrix(~ condition + batch + condition:batch) 最灵活
4. 想稳就跑两个：DESeq2 + edgeR 取交集作为高置信集，单工具独有的标注为"候选"
5. 不要只看 Venn 图：还要看不重叠基因的表达量和离散度，判断是模型差异还是真信号

在 BioF3 在线工具 一键跑 DESeq2，加载 airway Demo 数据即可体验。

结论​

AI 说"结果高度一致随便选"是因为它没有跑过真实数据。实测告诉你：重叠约 75-80%，不重叠的基因有明确特征（低表达 + 高离散 + 边界 fold change）。选工具不是看偏好，是看你的数据特点：小样本选 DESeq2，大样本选 edgeR，复杂设计选 limma-voom。

完整代码和 4 份数据集的详细对比表见 BioF3 bulk RNA-seq 02 章。

AI 会告诉你"resolution 在 0.4-1.2 之间试"。但不会告诉你 2700 个细胞和 50000 个细胞该差多少、组织样本和血液样本该差多少。这篇用 10 份真实数据集跑了 5 档 resolution，给你具体数字。

为什么 resolution 是单细胞分析最纠结的参数​

FindClusters() 的 resolution 决定 cluster 数量。设低了，T cell 和 NK cell 合成一团；设高了，同一个 CD4 T cell 被切成 5 个亚群——哪个都"对"，但哪个都可能是过度解读。

AI 答这个问题时只会说"0.4-1.2 之间，看 UMAP 调"。这不是错，但没用——新手看完还是不知道选几。

实测设计​

10 份公开 scRNA-seq 数据集，覆盖不同细胞数、组织来源、技术平台：

每份数据走相同流水线：QC（nFeature 200-6000, MT < 10%）→ LogNormalize → HVG 2000 → PCA 20 → UMAP → FindClusters resolution = 1.2。

核心结果​

不同 resolution 下的 cluster 数量​

规律：resolution 每增加 0.2，cluster 数大约增加 40-60%。细胞数越多，同一 resolution 下 cluster 数越多。

推荐初始值​

一句话：2700 个 PBMC 用 0.4，30000 个脑皮层用 0.8。不是"0.4-1.2 试"，是按细胞数 × 组织复杂度查表。

怎么判断 resolution 过高​

跑 clustree 包画聚类树：

library(clustree)
library(Seurat)

# 假设你跑了多个 resolution，存在 pbmc@meta.data 的 RNA_snn_res.0.X 列
clustree(pbmc, prefix = "RNA_snn_res.", resolution = c(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2))

如果 0.4 的 cluster 6 在 0.6 时分裂成 6a / 6b，但两者 marker 基因几乎一样 → 过度切碎，退回 0.4。如果分裂后 marker 明显不同（6a 是 CD4 naive，6b 是 CD4 memory）→ 分裂合理，保留 0.6。

实操建议​

1. 先按上表选初始 resolution，不要从 0.4 开始无脑试
2. 跑 clustree 看分裂稳定性，确认没有过度切碎
3. 用已知 marker 验证：CD3E（T cell）、MS4A1（B cell）、NKG7（NK cell）是否分在不同 cluster
4. BioF3 云平台默认 0.5，适合 PBMC 3k 这类入门数据；自己的数据在 03 章教程基础上调整

在 BioF3 云平台 一键跑 PBMC 3k 标准流水线，默认 resolution=0.5，可自行修改对比。

结论​

AI 说"0.4-1.2 试"是因为它没有实测数据。实测告诉你：resolution 的选择主要取决于细胞数和组织复杂度，按表查比盲目试更高效。10 个数据集的完整代码和 UMAP 对比图可在 BioF3 单细胞 03 章 跑通后自行复现。

把 ML 教程做成"打开就能跑"的专栏 — 这件事 BioF3 在过去两周一口气做完了:12 章正文 + 7 个在线工具 + 4 套真实公开数据 + 全部 5 死规则达标。这篇博客讲 ML 专栏现在能干什么、跟纯文档教程有什么不同、谁会直接受益。

BioF3 v3.1 不引入新功能，把 v3.0 留下的"基础底座"扎牢：11 个在线分析工具的所有图，全部从默认 R 风格升级到 SCI 论文风格，每张图同时输出 PNG（300dpi 屏幕看）+ PDF（Cairo 矢量，直接发表）。

这篇博客讲三件事：v3.1 修了什么、跟 v3.0 有什么不同、哪些用户会从这次升级直接受益。

BioF3 v3.0 上线，把"中文生信教程站 + 单细胞云平台"重新组织成了一件事：AI 陪伴的全组学学习平台。

这篇博客讲三件事：v3.0 在做什么、跟之前有什么不同、以及哪些用户会从这次升级里受益。

BioF3 是一份面向中文读者的组学数据分析实践教程。我们做这件事的起点很简单：自己学分析的时候很多教程只到 "跑个 demo 就好"，真要带到自己的数据上，总差那么几步。于是决定把每个模块都写成 "装包、取数据、跑出结果、能解释" 的完整链路。

单细胞转录组测序（scRNA-seq）把"测一个样本平均表达"提升到"一个样本里每个细胞表达多少"。它让"细胞异质性"、"稀有亚群"、"连续分化状态"这些原来只能靠流式或免疫组化间接看到的现象，第一次能在大规模基因表达层面直接分析。

本文简单讲清它和 bulk RNA-seq 的区别、一条标准分析链有哪些步骤、以及你在 BioF3 里可以按什么顺序学。

做完单组学分析，很多项目下一步的自然问题就是："这个结果在另一层组学上成立吗？"单组学给出的是一个切面：基因组变异能解释一部分表型，但不直接告诉你表达是否真的发生变化；转录组能看到 mRNA 差异，但不直接对应蛋白层的改变；甲基化和染色质状态的差异也要经由表达才能解释到表型。多组学整合的目的就是把不同层面的证据放到一个框架里，相互印证，或相互约束。

本文讲多组学整合的三种常见策略（早期/中期/晚期整合），和几种主流工具的适用边界。完整可运行的代码示例在 多组学整合实践教程 里，用 MOFA2 自带的 CLL 数据集就能跑起来。

做生信分析时最容易踩的一个坑是："这个工具的名字我听说过很多次，但不知道它在整条流水线里的哪个位置"。结果是收藏夹里堆满 GitHub 链接，每次开始新项目还是从零找工具。

这篇文章把我们常用的一些工具按实际工作流分层列出来，每类工具只给一到两个首选。不追求"最全"，只说"从单细胞或 bulk 项目一路到发表，大致在哪些步骤用什么"。