05 缺失值的两种来源与策略对比

蛋白质组学的缺失值不是噪声，而是信息：为什么这个样本里测不到这个蛋白？是丰度真的低于检测限（MNAR，missing not at random），还是仪器本次没扫到（MCAR，missing completely at random）？两种来源对应不同的插补策略，用错会引入系统偏差。

两种缺失模式

类型	直观含义	典型表现	推荐策略
MNAR	蛋白真的没表达或低于检测限	同一蛋白在某组全部缺失	左截断分布插补（MinProb、QRILC）
MCAR	仪器随机漏扫	缺失分散，组间均匀	KNN、最近邻、直接删除

实际数据里两种几乎总是混合。识别方法：看缺失分布。

library(naniar)
library(ggplot2)

# proteinGroups.txt 已读入为 prot_mat（行：蛋白，列：样本）
gg_miss_var(prot_mat, show_pct = TRUE)

如果某些蛋白只在某一组缺失，多半是 MNAR；如果缺失零散且与样本注入顺序相关，多半是仪器层面的 MCAR。

DEP 包的混合策略

DEP 默认按蛋白判断 MNAR：如果某蛋白在某条件下完全缺失，认为是 MNAR，用左截断（MinProb）插补；其他用 KNN。

library(DEP)

# data_filt 是 SummarizedExperiment 对象
data_imp <- impute(data_filt, fun = "MinProb", q = 0.01)

# 或显式混合策略
data_imp <- impute(data_filt, fun = "man",
                   shift = 1.8, scale = 0.3)  # MNAR 部分

# 仅 KNN
data_imp <- impute(data_filt, fun = "knn", k = 5)

三种策略的对比实验

下面这段对同一份数据跑三种插补，看下游差异蛋白结果差多少。

library(DEP)
library(dplyr)

run_pipeline <- function(se, fun, ...) {
  imp <- impute(se, fun = fun, ...)
  diff <- test_diff(imp, type = "control", control = "Ctrl")
  add_rejections(diff, alpha = 0.05, lfc = 1)
}

mp  <- run_pipeline(data_filt, "MinProb", q = 0.01)
knn <- run_pipeline(data_filt, "knn", k = 5)
mix <- run_pipeline(data_filt, "MinProb", q = 0.01)  # default in DEP

# 比较显著蛋白集
sig <- function(x) rowData(x)$significant %>% which() %>% rownames(rowData(x))[.]
length(intersect(sig(mp), sig(knn)))
length(setdiff(sig(mp), sig(knn)))

经验：MNAR-only 策略往往会高估"组特异性蛋白"的差异；KNN-only 会把真正的 MNAR 蛋白稀释到组间均值。混合策略（DEP 默认）通常最稳。

报告中如何写

差异蛋白结果表里建议加两列：imputed_in_n_samples 和 imputation_method，让读者能区分"测到的差异"和"插出来的差异"。审稿人最常问的就是这一点。

res_table <- get_results(mix) %>%
  mutate(
    imputed_in_n_samples = rowSums(is.na(assay(data_filt)[ID, ])),
    imputation_method = ifelse(imputed_in_n_samples > n_samples / 2,
                                "MinProb", "KNN")
  )

常见坑

坑 1：MinProb 插补在 MCAR 场景下引入负偏差

MinProb 从分布左尾采样，假设缺失是因为"丰度低于检测限"。但如果某个高丰度蛋白只是因为仪器随机漏扫而缺失（MCAR），MinProb 会给它一个远低于真实值的插补值，导致该蛋白被错误地判为"下调"。混合策略（先判断 MNAR/MCAR，再分别处理）更安全。

坑 2：KNN 插补让组间差异缩小

KNN 用邻近样本的均值填充，如果邻居来自不同条件组，插补值会趋向组间均值，抹平真实的组间差异。在分组数据中，KNN 应该限制邻居在组内选取（impute.knn 默认不区分组）。

坑 3：插补前没检查缺失率

对缺失率 > 70% 的蛋白做插补，结果几乎全是"编"出来的。这些蛋白的差异分析结果不可信。建议：缺失率 > 50% 的蛋白在差异分析后标注为"低置信度"，或者直接在插补前过滤掉。

坑 4：插补策略换了但结论差异大却不讨论

三种插补方法给出的显著蛋白列表只有 60% 重叠。很多人只跑一种就报告结果。稳健的做法是：跑 2-3 种插补策略，取交集作为高置信度候选，差集列为"插补敏感"蛋白并在讨论中说明。

下一步

接着深入：

• 02 DEP 差异蛋白分析 — 完整 DEP 管线中的插补步骤
• 06 翻译后修饰：磷酸化位点定量 — PTM 数据的缺失值更复杂

横向延伸：

• 多组学整合 02 数据清洗 — 蛋白组 KNN 插补在整合流程中的位置
• 多组学整合 05 MOFA2 — MOFA2 能直接处理缺失值，不需要预先插补

参考资源

• DEP 官方手册的 imputation 章节
• Lazar 等人的对比文章 "Accounting for the multiple natures of missing values in label-free quantitative proteomics data sets"（J. Proteome Res. 2016）
• naniar 包文档：缺失值可视化