01 实验类型与数据格式

表观组学实验类型多，但分析思路可以归为两大类：开放区域检测（ATAC-seq、DNase-seq）和蛋白-DNA 结合检测（ChIP-seq）。两者的分析流程几乎一样，区别在 peak calling 参数和质量指标。

三种主要实验

实验	测什么	peak 类型	典型 QC 指标
ATAC-seq	染色质开放区域	narrow	TSS enrichment、fragment size 分布
ChIP-seq	TF 结合位点 / 组蛋白修饰	narrow (TF) / broad (histone)	FRiP、IDR
WGBS/RRBS	DNA 甲基化	不做 peak calling	覆盖度、转化率

本专栏前 4 个模块聚焦 ATAC-seq 和 ChIP-seq（它们共享 peak-based 分析框架）。甲基化后续单独开。

从 FASTQ 到 peak 文件

不管是 ATAC 还是 ChIP，从原始数据到可分析的 peak 文件，标准流程是：

FASTQ → fastp (trim) → Bowtie2/BWA (align) → samtools (sort/filter)
     → Picard (dedup) → MACS2 (peak calling) → narrowPeak / broadPeak

BioF3 的表观组教程从 peak 文件开始。如果你需要从 FASTQ 跑起，参考 nf-core/chipseq 或 nf-core/atacseq 流水线。

peak 文件格式

MACS2 输出的 .narrowPeak 是 BED6+4 格式：

chr1  9356548  9356648  peak_1  100  .  5.0  10.5  7.2  50

列	含义
1-3	染色体、起始、终止
4	peak 名
5	score
6	strand（通常 .）
7	fold enrichment
8	-log10(pvalue)
9	-log10(qvalue)
10	summit 相对于 start 的偏移

R 里用 ChIPseeker::readPeakFile() 或 rtracklayer::import() 读入，得到 GRanges 对象。

怎么判断这份数据值不值得分析

拿到 peak 文件先做的不是注释或差异分析，而是判断这份数据本身值不值得花时间分析。三件事看一下：

1. peak 总数在合理范围

实验	健康范围
TF ChIP-seq	5,000 - 50,000
组蛋白 ChIP-seq (broad)	20,000 - 100,000
ATAC-seq	30,000 - 200,000
ATAC-seq（高深度细胞）	可达 50 万

数量过少（< 1000）说明 IP 效率低或测序深度不足；数量异常多（> 100 万）多半是没正确去 input。

2. FRiP（fraction of reads in peaks）

FRiP = peak 区域 reads / 总比对 reads。好数据 FRiP > 0.2（ENCODE 严格要求 > 0.3），低于 0.05 基本不可用。这是辨识"真信号 vs 全是噪声"最直接的指标。

3. peak 在 TSS 附近富集

把 peak 中心和 TSS 距离画分布图，应该在 TSS 附近有明显尖峰。ATAC 的 TSS enrichment > 6 是常见门槛。如果 TSS 周围没有富集，说明实验失败或 chromatin 没有被有效打开。

这三件事 5 分钟就能查完，比闷头跑两天后发现数据没法用强多了。

常见坑

坑 1：参考基因组版本不一致

peak 文件、注释 GTF、TxDb 三者必须用同一个基因组版本。hg19 的 peak 配 hg38 的 TxDb 不会报错但坐标全错。看 peak 文件第一行染色体名（"chr1" vs "1"）和 TxDb 文档对一下。

坑 2：narrowPeak 当 broadPeak 用

TF / DNase / ATAC 用 narrowPeak（带 summit 列）；组蛋白修饰（H3K27me3、H3K4me3 etc）用 broadPeak（没有 summit 列）。强行把 broadPeak 当 narrowPeak 读会丢失信息，downstream motif 分析无法定位准确位置。

坑 3：peak 文件没有按染色体大小过滤

线粒体、未定位的 contig（chrUn_）、ENCODE blacklist 区域常出现假阳性 peak。call peak 后用 ENCODE blacklist BED 文件做一次 bedtools intersect -v 过滤掉，能去掉 5-15% 的假信号。

坑 4：把 BAM 里 MAPQ 低的 reads 也用了

ATAC / ChIP 的标准要求 MAPQ ≥ 30（Bowtie2 default）或 ≥ 10。MAPQ 低的 reads 可能是多处比对（重复区域），保留会让重复区域出现假 peak。

坑 5：paired-end ATAC 用 single-end 模式 call peak

-f BAM 是 single-end 模式，但 ATAC 是 paired-end，会丢一半信息。paired-end ATAC 必须 -f BAMPE，这一点和 ChIP-seq 不一样。

下一步

接着深入：

• 02 Peak 注释与多样本比较 — 把 peak 文件里那一坨基因组坐标变成"哪些基因"
• 06 ATAC-seq 分析要点 — 如果你的数据是 ATAC，先看这一篇了解关键差异

横向延伸：

• 02 原始数据处理与 Cell Ranger — bulk ATAC 的 BAM 处理思路和单细胞 Cell Ranger 类似
• nf-core/chipseq 流水线 — 完整的 FASTQ → peak 自动化方案

参考资源

• MACS2 文档
• nf-core/chipseq
• nf-core/atacseq
• ENCODE 实验标准