BioF3 组学数据分析

01 质谱结果表与实验设计

导出日期：2026年6月27日

01 质谱结果表与实验设计

这一章的目标是让读者在动手做差异蛋白分析之前，先搞清楚"手上拿到的是什么格式的表、每一列代表什么、实验设计怎么对应到分析里"。

质谱数据处理的起点

蛋白质组学的原始数据是质谱仪产出的 .raw / .mzML 文件。这些文件需要经过数据库搜索（DDA）或者谱图库匹配（DIA）才能得到蛋白鉴定和定量结果。常用的处理工具：

工具 适用 输出
MaxQuant DDA proteinGroups.txt、evidence.txt
FragPipe DDA combined_protein.tsv
DIA-NN DIA report.pg_matrix.tsv
Spectronaut DIA 自定义导出表

BioF3 的蛋白组教程从这些工具的输出表开始，不涉及原始质谱数据处理。

MaxQuant proteinGroups.txt 的关键列

MaxQuant 是目前最常用的 DDA 处理工具。它的 proteinGroups.txt 是一张宽表，每行一个蛋白组（protein group），关键列：

列名 含义
Protein IDs UniProt accession，多个用分号分隔
Gene names 基因名（用于可视化和富集）
LFQ intensity XXX 每个样本的 Label-Free Quantification 强度
iBAQ XXX 另一种定量方式（绝对丰度估计）
Razor + unique peptides 用于该蛋白定量的肽段数
Reverse 是否匹配到反向库（应过滤掉）
Potential contaminant 是否是常见污染物（应过滤掉）
Only identified by site 是否仅通过修饰位点鉴定（通常过滤掉）

读入后第一件事：过滤掉 Reverse == "+" 和 Potential contaminant == "+" 的行。这些不是真正的样本蛋白。

实验设计表

和 bulk RNA-seq 一样，蛋白组分析也需要一张样本表把"哪个列对应哪个条件"说清楚。DEP 包要求的格式：

label      condition  replicate
Sample1    Control    1
Sample2    Control    2
Sample3    Control    3
Sample4    Treatment  1
Sample5    Treatment  2
Sample6    Treatment  3

缺失值：蛋白组的核心难题

和转录组最大的区别：蛋白组的缺失值非常多。一个蛋白在某些样本里完全没有信号（LFQ = 0 或 NA），原因可能是：

两种缺失的处理策略不同：MNAR 通常用"从分布左尾采样"（MinProb）来插补；MCAR 可以用 KNN 或均值插补。DEP 默认用 MinProb，适合大多数蛋白组场景。

从 proteinGroups.txt 到 DEP 对象

DEP 包把上面这些步骤封装成几个函数：

library(DEP)

# 1. 读入 MaxQuant 结果
data <- read.delim("proteinGroups.txt")

# 2. 过滤污染和反向库
data <- data[data$Reverse != "+", ]
data <- data[data$Potential.contaminant != "+", ]

# 3. 确保蛋白名唯一
data_unique <- make_unique(data, "Gene.names", "Protein.IDs", delim = ";")

# 4. 构建 SummarizedExperiment
lfq_cols <- grep("LFQ.intensity.", colnames(data_unique))
data_se <- make_se(data_unique, lfq_cols, experimental_design)

make_se 之后得到的是一个标准的 Bioconductor SummarizedExperiment 对象，后续的过滤、归一化、插补、差异分析都在这个对象上操作。

下一步

常见坑

坑 1：把 LFQ intensity = 0 当作"表达量为 0"

MaxQuant 输出中 LFQ intensity = 0 表示"未检测到"，不是"蛋白不存在"或"丰度为零"。直接 log2(0) 会产生 -Inf。正确做法是把 0 替换为 NA，后续用缺失值插补策略处理。

坑 2：用 counts（肽段数）做差异分析

Spectral count 或 peptide count 虽然和丰度正相关，但不适合做精确的定量比较——它是离散的、非线性的，且受蛋白长度影响。差异分析应该用 intensity-based 定量（LFQ、TMT ratio），counts 只适合粗略筛选。

坑 3：归一化方式选错

蛋白组常用中位数归一化或 VSN。如果数据已经是 log2 转换后的，再跑 VSN 会产生奇怪的方差结构。确认输入数据的 scale（原始 intensity vs log2 intensity），再选归一化方法。DEP 的 normalize_vsn 内部会自动 log2 转换。

坑 4：实验设计表的 label 和 LFQ 列名对不上

DEP 要求 experimental_design$label 精确匹配 LFQ.intensity. 后面的后缀。如果 MaxQuant 里样本名有空格或特殊字符，R 读入后会被替换成点号，导致匹配失败。建议一开始就用简单的 alphanumeric 命名。

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参考资源