01 从数据到项目结构

这一章的目标是让读者在真正动手做 bulk RNA-seq 之前，先把"拿到什么输入、打算得到什么输出"想清楚。很多项目一开始跑得很顺，到了复盘阶段才发现样本表有问题、目录结构乱、中间文件丢了。bulk RNA-seq 的数据量比单细胞小得多，但分析链条更长，更值得一开始就把项目结构定下来。

一个典型项目的输入和输出

以最常见的两组比较为例：对照 vs 处理，每组 3 个生物学重复，每个样本一次双端测序。你手上会有的东西和最后要交付的东西大致是：

"样本表"是整条链路的中心。它至少要有：样本 ID、条件、批次、测序时间、FASTQ 路径。后面每一步都要回到这张表。

项目目录

长期维护的目录结构没有标准答案，但至少应该满足"6 个月后回来还知道每个文件是什么"。一个可用的结构：

rnaseq_project/
├── README.md                # 项目背景、样本来源、关键决策
├── metadata/
│   └── samples.tsv          # 样本表，唯一可信来源
├── data/
│   ├── raw/                 # 原始 FASTQ（不动）
│   ├── qc/                  # FastQC + MultiQC 报告
│   ├── align/               # BAM 或 Salmon quant
│   └── counts/              # 合并后的 counts 矩阵
├── analysis/
│   ├── 01-qc.R
│   ├── 02-de.R              # DESeq2 / edgeR
│   ├── 03-enrichment.R
│   └── 04-figures.R
├── results/
│   ├── tables/
│   └── figures/
└── envs/
    └── env.yaml             # conda 环境，锁定版本

几个经验：

• data/raw/ 只读，永远不直接修改，新文件写到其他目录
• 分析脚本按步骤命名（01-, 02-...），从上到下能复现整个流程
• results/ 只放最终交付物，中间产物放 data/
• envs/env.yaml 锁版本，过两个月再跑也能装回原环境

样本表怎么写

样本表是一个纯文本 TSV，越简单越好。一个最小可用版本：

sample_id	condition	batch	r1	r2
CTRL_1	untreated	1	data/raw/CTRL_1_R1.fastq.gz	data/raw/CTRL_1_R2.fastq.gz
CTRL_2	untreated	1	data/raw/CTRL_2_R1.fastq.gz	data/raw/CTRL_2_R2.fastq.gz
CTRL_3	untreated	2	data/raw/CTRL_3_R1.fastq.gz	data/raw/CTRL_3_R2.fastq.gz
TRT_1	treated	1	data/raw/TRT_1_R1.fastq.gz	data/raw/TRT_1_R2.fastq.gz
TRT_2	treated	1	data/raw/TRT_2_R1.fastq.gz	data/raw/TRT_2_R2.fastq.gz
TRT_3	treated	2	data/raw/TRT_3_R1.fastq.gz	data/raw/TRT_3_R2.fastq.gz

batch 这一列不一定用得到，但有分析经验之后你会知道：一开始就记录下来是最便宜的，事后补很贵。测序批次、试剂批次、操作人、文库类型，只要是可能引入系统偏差的变量都值得留一列。DESeq2 的 design 会直接用到这些列：

design = ~ batch + condition

参考基因组和注释

人和小鼠的参考基因组有几个主流来源：

基因组和注释必须来自同一个来源、同一个版本，不然基因 ID 和坐标就对不上。推荐直接下载 GENCODE 的 primary assembly + 主注释 GTF，搭配 Salmon 或 STAR 都能跑：

# 人 v44 作为例子
wget -c https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_44/GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz
wget -c https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_44/gencode.v44.primary_assembly.annotation.gtf.gz

这两个文件解压后占 6~7 GB，落到 data/reference/ 里，长期项目里这份东西是共享的，不跟单个项目耦合。

比对 vs 准比对

两条主流路线：

新项目如果只做差异表达和富集，用 Salmon 几乎是最佳选择 —— 笔记本上几分钟就能定量一个样本。下面这段是 Salmon 的典型调用：

# 建立索引（只做一次）
salmon index \
  -t gencode.v44.transcripts.fa.gz \
  -i salmon_index \
  --gencode

# 定量每个样本
for s in CTRL_1 CTRL_2 CTRL_3 TRT_1 TRT_2 TRT_3; do
  salmon quant \
    -i salmon_index \
    -l A \
    -1 data/raw/${s}_R1.fastq.gz \
    -2 data/raw/${s}_R2.fastq.gz \
    -p 8 --validateMappings \
    -o data/align/${s}
done

定量完成后每个样本会得到一个目录，里面的 quant.sf 就是转录本级别的定量结果。后续在 R 里用 tximport 聚合到基因级就进入差异分析：

library(tximport)
library(readr)

samples <- read.table("metadata/samples.tsv", header = TRUE, sep = "\t")
files <- file.path("data/align", samples$sample_id, "quant.sf")
names(files) <- samples$sample_id

# tx2gene 映射（从 GTF 生成一次就好）
tx2gene <- readr::read_tsv("metadata/tx2gene.tsv")

txi <- tximport(files, type = "salmon", tx2gene = tx2gene)
# txi$counts 就是 gene x sample 的 counts 矩阵

快速跳过：直接用 airway / pasilla

上面这套是面向真实项目的；如果只是想学习差异分析，完全可以跳过 FASTQ → BAM → counts 这一段，直接用 Bioconductor 已经打包好的 counts 数据：

• airway — 人肺上皮 8 样本（4 对照 + 4 糖皮质激素处理），DESeq2 官方教程数据
• pasilla — 果蝇 7 样本，DESeq2 最小例子

后面 02、03、04 的真实示例都用 airway，装上包就能跑，不用碰比对流程。

常见坑

坑 1：样本表用 Excel 编辑导致格式错乱

Excel 会自动把 MARCH1（基因名）改成日期、把数字前补 0 删掉、改空格成 unicode。永远用纯文本编辑器或 R / Python 维护样本表，要看的时候再 read.delim 进来。

坑 2：参考基因组版本和注释不匹配

下载 GRCh38 fasta 配 GENCODE v44 GTF 没问题；但配 v25 GTF 会出现"基因名对得上、坐标对不上"的诡异错误。fa 和 gtf 必须来自同一来源同一版本，不要混用。

坑 3：把 raw counts 当成已归一化的 TPM

featureCounts 出来的是 raw counts（整数），可以直接喂 DESeq2 / edgeR；但 Salmon / kallisto 的默认输出是 TPM 或估计 counts，给 DESeq2 时要用 tximport(..., type = "salmon") 转成 counts，不是直接读 quant.sf。

坑 4：Salmon 索引用错链路

--gencode 标志只对 GENCODE 来源的转录组用，Ensembl 来源的转录组不要加 --gencode。否则 transcript ID 在去版本号时会出错。

坑 5：把样本目录命名成数字开头

Linux 下排序看上去 1.fastq 2.fastq 没问题，但 R 读进来当数据框列名时会自动加 X 前缀（变成 X1、X2）。样本 ID 一律用字母开头（S1、CTRL_1），下游脚本省心。

下一步

接着深入：

• 02 DESeq2 差异表达分析 — counts 准备好之后的第一步，airway 公开数据可以直接跑

横向延伸：

• 03 GO / KEGG / GSEA 富集 — 如果你已经有差异基因表，可以直接跳到富集分析
• 06 批次效应 — 多批次样本要先想清楚 batch 怎么处理，再设计 design 公式

参考资源

• GENCODE
• Salmon 官方文档
• tximport 教程
• RNA-seq workflow (Bioconductor)