蛋白质组学实践教程

转录组告诉你哪些基因被转录，蛋白质组告诉你哪些蛋白真的被翻译、它们的丰度如何、以及是否被修饰。质谱是目前最常用的蛋白组测量手段：样本酶解后肽段上机，仪器给出质荷比和强度，数据库比对后得到蛋白身份和定量值。

做过转录组分析的读者上手蛋白组往往会遇到两个反差：数据维度小（几千个蛋白 vs 几万个基因）、缺失值多（某些蛋白在部分样本根本没测到）。因此思路上 bulk RNA-seq 的很多经验可以复用，但预处理和统计模型要调整。

本专栏假设原始质谱数据已经由 MaxQuant、FragPipe、DIA-NN、Spectronaut 等工具处理好，起点是一份带强度或 LFQ 值的蛋白表。

一个项目大致是什么样子

给你 20 个样本的 MaxQuant proteinGroups.txt 或 DIA-NN report.pg_matrix.tsv，从这里到一张能写进论文的差异蛋白结果，大致要走：

MaxQuant 和 FragPipe 是 DDA 的两条主流选择，DIA-NN 和 Spectronaut 面向 DIA 实验。处理好后的结果表在字段名上有差异，但后续的差异分析和富集分析可以共用。

常见工具栈

差异分析这一段，limma 仍然是最稳的选择，因为它对样本量小、噪音大、存在技术重复的实验设计非常友好。DEP 在 limma 之上包了一层适合蛋白组的数据流程，适合初学者。

推荐公开数据集

蛋白组的公开数据比转录组少，但以下几个入口能覆盖大多数教学需求：

DEP 包自带的 UbiLength 数据是 HeLa 细胞不同处理时间的泛素化组实验，8 个样本、大约 2700 个蛋白，规模合适教学，下面的最小例子也基于它。

最小可跑的例子

这段代码基于 DEP 包自带的真实数据。安装好包后能直接运行完成："读入 → 过滤 → 归一化 → 插补 → 差异分析 → 可视化" 一条链路：

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("DEP")

library(DEP)

# 自带真实数据：UbiLength MaxQuant 结果
data <- UbiLength
experimental_design <- UbiLength_ExpDesign

# 清洗：去除污染蛋白、反向库匹配、仅 1 肽鉴定的蛋白
data_unique <- make_unique(data, "Gene.names", "Protein.IDs", delim = ";")
data_se <- make_se(data_unique, grep("LFQ.", colnames(data_unique)), experimental_design)

# 过滤：每组至少两个样本里被测到
data_filt <- filter_missval(data_se, thr = 0)

# 归一化 + 缺失值插补
data_norm <- normalize_vsn(data_filt)
data_imp  <- impute(data_norm, fun = "MinProb", q = 0.01)

# 差异分析（limma 后端）
data_diff <- test_diff(data_imp, type = "control", control = "Ctrl")
dep <- add_rejections(data_diff, alpha = 0.05, lfc = 1)

# 火山图
plot_volcano(dep, contrast = "Ubi6_vs_Ctrl", label_size = 2, add_names = TRUE)

跑完后得到的是一张火山图，横轴是 log2 fold change，纵轴是 -log10(p)。被标注出来的蛋白就是这组对比下显著差异的候选，可以再去做富集分析或文献查证。

真实项目里有几件事比这段复杂：样本分组更多、协变量要纳入模型、DIA 数据的插补策略不同、要输出 MSstats 报告等等，但起步的框架就是这样。

专栏模块规划

目前 01-04 已上线，每个模块带一份可直接跑的 R 脚本。

推荐前置知识

• 编程基础：R、Python、Bash 学习路径
• R 数据整理与 ggplot2 可视化
• bulk RNA-seq 实践教程（差异分析思路有很多共通点）

参考资源

• DEP Bioconductor 文档
• limma 用户手册
• MaxQuant 官方文档
• FragPipe
• DIA-NN
• PRIDE Archive
• STRING 数据库