03 功能富集与 Reactome 通路
03 功能富集与 Reactome 通路
差异蛋白列表本身只是中间产物。真正有用的是"这些蛋白对应哪些通路"。本章用 02 DEP 差异分析 的结果，走一遍 GO + Reactome + GSEA。
思路和 bulk RNA-seq 03 富集 完全一致，只是输入从基因换成了蛋白（通过 gene symbol 映射到 Entrez ID）。
真实示例
配套脚本 prot03_enrichment_sci.R 在 UbiLength 的 Ubi6 vs Ctrl 差异蛋白上跑 GO BP、Reactome、GSEA：
Rscript scripts/proteomics/prot03_enrichment_sci.R
每张图看什么
图 1：GO biological process 富集 dotplot。泛素化相关通路（蛋白降解、泛素连接酶活性）排在最前面，符合实验设计。
图 2：Reactome 通路富集。Reactome 的通路粒度比 GO 更细，适合定位到具体的信号级联。
图 3：GO term 相似度网络。共享蛋白的 term 连在一起，帮助去冗余。
图 4：分别对上调和下调蛋白做 GO 富集。上调蛋白富集在泛素化相关通路，下调蛋白富集在代谢或稳态维持通路。
图 5：GSEA 瀑布图。不依赖阈值，直接看整条通路的蛋白是否整体偏向一个方向。
图 6：最强 NES 的 term 的 running-score 图。
下载资源
常见坑
坑 1：蛋白组的 background list 设错
ORA 富集需要一个背景集（universe）。蛋白组的背景应该是"本次实验中检测到的所有蛋白"，而不是全基因组 20000 个基因。用全基因组做背景会低估富集显著性，因为很多基因本来就测不到蛋白。
坑 2：Gene symbol 映射丢失大量蛋白
MaxQuant 的 Gene.names 列有时是空的或者包含多个名字（分号分隔）。直接取第一个可能丢失信息，全部展开又会引入重复。建议先检查映射率（成功映射到 Entrez/SYMBOL 的比例），< 80% 时要回头看是否需要换 ID 映射方式（UniProt → SYMBOL）。
坑 3：同 RNA-seq 一样的 p 值阈值可能不适用
蛋白组差异蛋白通常只有几十到几百个，做 ORA 时如果只有 20 个输入蛋白，很多通路的超几何检验统计功效不够。这时候 GSEA（用全部蛋白的 ranked list）比 ORA 更合适，不依赖硬阈值切割。
坑 4：忽略富集结果的冗余
GO 的层级结构会导致很多 redundant terms（比如 "protein ubiquitination" 和 "ubiquitin-dependent protein catabolic process" 高度重叠）。用 simplify() 或 enrichment map（emapplot）去冗余，否则论文里列出 50 个本质相同的 term 没有意义。
下一步
接着深入：
- 04 可视化：火山图、热图与蛋白互作 — 把富集结果和差异蛋白做成论文图
- 07 STRING 与蛋白互作网络 — 从通路级别到蛋白互作层面的解读
横向延伸：
- bulk RNA-seq 03 功能富集 — 相同的 GO/GSEA 方法论在转录组中的应用
- 多组学整合 08 生物学解读 — 多层数据的联合富集分析