BioF3 组学数据分析
01 质谱结果表与实验设计
01 质谱结果表与实验设计
这一章的目标是让读者在动手做差异蛋白分析之前，先搞清楚"手上拿到的是什么格式的表、每一列代表什么、实验设计怎么对应到分析里"。
质谱数据处理的起点
蛋白质组学的原始数据是质谱仪产出的 .raw / .mzML 文件。这些文件需要经过数据库搜索（DDA）或者谱图库匹配（DIA）才能得到蛋白鉴定和定量结果。常用的处理工具：
| 工具 | 适用 | 输出 |
|---|---|---|
| MaxQuant | DDA | proteinGroups.txt、evidence.txt |
| FragPipe | DDA | combined_protein.tsv |
| DIA-NN | DIA | report.pg_matrix.tsv |
| Spectronaut | DIA | 自定义导出表 |
BioF3 的蛋白组教程从这些工具的输出表开始，不涉及原始质谱数据处理。
MaxQuant proteinGroups.txt 的关键列
MaxQuant 是目前最常用的 DDA 处理工具。它的 proteinGroups.txt 是一张宽表，每行一个蛋白组（protein group），关键列：
| 列名 | 含义 |
|---|---|
Protein IDs |
UniProt accession，多个用分号分隔 |
Gene names |
基因名（用于可视化和富集） |
LFQ intensity XXX |
每个样本的 Label-Free Quantification 强度 |
iBAQ XXX |
另一种定量方式（绝对丰度估计） |
Razor + unique peptides |
用于该蛋白定量的肽段数 |
Reverse |
是否匹配到反向库（应过滤掉） |
Potential contaminant |
是否是常见污染物（应过滤掉） |
Only identified by site |
是否仅通过修饰位点鉴定（通常过滤掉） |
读入后第一件事：过滤掉 Reverse == "+" 和 Potential contaminant == "+" 的行。这些不是真正的样本蛋白。
实验设计表
和 bulk RNA-seq 一样，蛋白组分析也需要一张样本表把"哪个列对应哪个条件"说清楚。DEP 包要求的格式：
label condition replicate
Sample1 Control 1
Sample2 Control 2
Sample3 Control 3
Sample4 Treatment 1
Sample5 Treatment 2
Sample6 Treatment 3
label要和proteinGroups.txt里LFQ intensity列名的后缀对得上condition是分组变量（后面做差异分析的对比就基于它）replicate是生物学重复编号
缺失值：蛋白组的核心难题
和转录组最大的区别：蛋白组的缺失值非常多。一个蛋白在某些样本里完全没有信号（LFQ = 0 或 NA），原因可能是：
- MNAR（Missing Not At Random）：蛋白丰度太低，低于检测限 → 这种缺失和真实丰度有关
- MCAR（Missing Completely At Random）：随机的技术波动 → 和丰度无关
两种缺失的处理策略不同：MNAR 通常用"从分布左尾采样"（MinProb）来插补；MCAR 可以用 KNN 或均值插补。DEP 默认用 MinProb，适合大多数蛋白组场景。
从 proteinGroups.txt 到 DEP 对象
DEP 包把上面这些步骤封装成几个函数：
library(DEP)
# 1. 读入 MaxQuant 结果
data <- read.delim("proteinGroups.txt")
# 2. 过滤污染和反向库
data <- data[data$Reverse != "+", ]
data <- data[data$Potential.contaminant != "+", ]
# 3. 确保蛋白名唯一
data_unique <- make_unique(data, "Gene.names", "Protein.IDs", delim = ";")
# 4. 构建 SummarizedExperiment
lfq_cols <- grep("LFQ.intensity.", colnames(data_unique))
data_se <- make_se(data_unique, lfq_cols, experimental_design)
make_se 之后得到的是一个标准的 Bioconductor SummarizedExperiment 对象，后续的过滤、归一化、插补、差异分析都在这个对象上操作。