02 原始数据处理与 Cell Ranger
速答
Q: Cell Ranger 做了什么？ A: 三步：识别 barcode（每条 read 属于哪个细胞）→ UMI 去重 → 比对到参考基因组并计数。输出"基因 × 细胞"表达矩阵。
Q: Cell Ranger 跑一次需要多少资源？ A: 约 64 GB 内存 + 数小时 CPU。普通笔记本跑不动，建议用服务器或云平台。
Q: web_summary 里最该看哪些指标？ A: 测序饱和度（Sequencing Saturation，>50% 为佳）、比对率（Reads Mapped to Genome，>70%）、双细胞比例（Doublet Rate，<10% 为佳）、每个细胞的 median gene 数。
Q: 有现成表达矩阵还需要跑 Cell Ranger 吗？ A: 不需要。公开数据集（PBMC 3k 等）已经是 Cell Ranger 产物，直接跳到 03 章做下游分析。
02 原始数据处理与 Cell Ranger
测序下机拿到的是一堆 FASTQ 文件，里面按 read 顺序存着每条 reads 的碱基序列和质量值。要把这些原始 reads 变成"基因 × 细胞"的表达矩阵，需要经过三件事：识别每条 read 属于哪个细胞（barcode）、去除重复分子（UMI 去重）、比对到参考基因组并数每个基因有多少条 reads。对于 10x Chromium 技术平台，把这三件事打包起来做的软件就是 Cell Ranger。
本节介绍 10x 单细胞数据的基本结构、Cell Ranger 的工作流程和典型用法，以及产出之后如何用 Seurat / Scanpy 读进来。真正做分析需要约 64 GB 内存和若干小时 CPU 时间，如果你的机器达不到，这里贴的命令可以先放一放，直接用01 章下载好的 PBMC 3k 表达矩阵继续往下走。
这一章可以先跳过吗
可以，但建议至少读完"web_summary 里看什么"那一节。
理由：
- 大部分公开数据集（PBMC 3k、CITE-seq 5k、Visium 等）都已经是 Cell Ranger 跑完的产物，初学者可以直接进入 03 章
- 但凡用别人发表的数据，作者贴出来的 web_summary 是评价这份数据可用性的第一手依据 — 测序饱和度低、双细胞高、比对率差，下游分析再花俏也救不回来
- 等你有自己的 FASTQ 时再回头跑一次 cellranger count，那时已有 03/04 章的下游基础，更容易看懂结果
为什么是 Cell Ranger 而不是 STARsolo / kallisto-bustools
三个工具都能从 10x FASTQ 生成表达矩阵，但 10x 官方报告（web_summary、metrics_summary）只有 Cell Ranger 能产出。这意味着：
- 投稿时审稿人 / GEO 提交时数据库期望看到 web_summary 的那些标准指标
- 多样本汇总（aggr）、loupe 浏览器只认 Cell Ranger 输出
- STARsolo 速度快约 3-5 倍、kallisto-bustools 占内存少，但产出格式与 Cell Ranger 不完全互通
教学场景和发表项目都用 Cell Ranger。生产 pipeline 跑大批量样本时再考虑替代品。
10x 单细胞数据的基本结构
10x Chromium 用微流控芯片把细胞和含 barcode 的凝胶珠一起包进油滴（GEM），每个 GEM 里最多一个细胞和一颗珠子。同一细胞的所有 mRNA 都会被打上相同的 cell barcode，同一 mRNA 分子经过反转录后会携带唯一的 UMI。这两个标识让"哪条 reads 来自哪个细胞、哪条 reads 来自同一分子"变得可以在下游分析里重建出来。
图 1：PBMC 3k 真实 filtered matrix 的关键统计，包括细胞数、矩阵基因数、检出基因数、中位 UMI、中位基因数和中位线粒体比例。
FASTQ 文件的组织方式
10x 的 FASTQ 常见命名是 {sample}_S1_L001_R1_001.fastq.gz 这种格式，三个角色：
R1：16 bp 的 cell barcode + 10 bp 的 UMI（v3 chemistry；v2 是 14+10）+ Poly-TR2：测到的 cDNA 序列本体I1（可选）：样本索引，多样本混合上机时区分样本
图 2：FASTQ 文件结构示意图。展示了 Read 1 和 Read 2 中各组成部分的长度和位置。
单条 FASTQ record 的内容就是 4 行格式：
@序列ID
ATCGATCGATCG...
+
IIIIIIIIIIII...
Cell Ranger 做什么
Cell Ranger 的 cellranger count 命令把一组 FASTQ 变成一份可直接读进 Seurat / Scanpy 的表达矩阵。过程大致是：识别 cell barcode 并做纠错 → 去除 UMI 重复 → 用 STAR 比对 R2 到参考基因组 → 根据比对结果给每个 (cell, gene) 累加 UMI 数 → 用 EmptyDrops 等算法判断哪些 barcode 对应的是真实细胞。输出里最重要的是 filtered_feature_bc_matrix/ 和 web_summary.html。
系统要求
Cell Ranger 8 只在 Linux 下官方支持（没有 macOS/Windows 版本）。一个常规 PBMC 样本大约要 8 核 CPU、64 GB 内存和几百 GB 磁盘；大样本或同时跑多个按比例加码。
安装 Cell Ranger
Cell Ranger 本身需要到 10x Genomics 下载页登录索取下载链接（每个链接都有时效）。拿到 URL 后：
wget -O cellranger-8.0.0.tar.gz \
"你从 10x 下载页拿到的带签名的 URL"
tar -xzvf cellranger-8.0.0.tar.gz
export PATH=/path/to/cellranger-8.0.0:$PATH
cellranger --version
参考基因组按物种下载对应版本：
# 人 GRCh38
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz
# 鼠 mm10
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2024-A.tar.gz
tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz
跑一次 cellranger count
图 3：PBMC 3k 真实矩阵的输出检查点。图中展示参考基因数、实际检出基因数、filtered cell barcode 数和按本教程阈值保留的细胞数。
一个标准调用：
cellranger count \
--id=PBMC_sample1 \
--transcriptome=/data/refdata-gex-GRCh38-2024-A \
--fastqs=/data/fastq/PBMC \
--sample=PBMC_1 \
--localcores=16 \
--localmem=128
重要参数：
| 参数 | 作用 | 备注 |
|---|---|---|
--id |
输出目录名 | 同时也是后续报告里的 sample ID |
--transcriptome |
参考基因组路径 | 必须和测序样本物种对得上 |
--fastqs |
FASTQ 所在目录 | 多 lane 用逗号分隔，如 /lane1,/lane2 |
--sample |
样本前缀 | Cell Ranger 会匹配 {sample}_S*_L*_R*_001.fastq.gz |
--localcores |
CPU 核心数 | 通常 8-16，受机器限制 |
--localmem |
内存上限（GB） | 至少 64；高 UMI 样本更多 |
--expect-cells |
预期细胞数 | 芯片说明书会给，不给默认按 EmptyDrops 自适应 |
--chemistry |
chemistry 版本 | 大多数情况下可以留 auto |
Cell Ranger 除了 count 还有 aggr（多样本合并）、reanalyze（改参数重分析）、mkref（自建参考）这几个子命令，日常最常用的还是 count。
输出目录结构
sample_01/
└── outs/
├── web_summary.html # QC 网页报告（必看）
├── metrics_summary.csv # web_summary 的数据版
├── filtered_feature_bc_matrix/ # 过滤后的表达矩阵（下游分析用）
│ ├── barcodes.tsv.gz
│ ├── features.tsv.gz
│ └── matrix.mtx.gz
├── filtered_feature_bc_matrix.h5
├── raw_feature_bc_matrix/ # 未过滤矩阵，做 EmptyDrops 调参时用
├── raw_feature_bc_matrix.h5
├── possorted_genome_bam.bam # 比对结果，可视化或 velocity 用
├── possorted_genome_bam.bam.bai
├── molecule_info.h5 # 每个 UMI 的分子级信息，aggr 要用
└── cloupe.cloupe # Loupe Browser 专用
filtered_feature_bc_matrix/ 下是典型的 10x 三件套：
barcodes.tsv.gz # 每行一个细胞 barcode
features.tsv.gz # 每行一个基因：ENSEMBL_ID symbol Gene Expression
matrix.mtx.gz # 稀疏矩阵（MatrixMarket 格式）
filtered_feature_bc_matrix.h5 是同样的信息压缩成单个 HDF5 文件，Seurat 和 Scanpy 都能直接读，对后续自动化脚本更方便。
web_summary 里看什么
图 4：质量控制指标分布。展示了基因数、UMI 数和线粒体基因比例的分布情况，红色虚线表示质量控制阈值。
跑完之后第一件事是在浏览器里打开 outs/web_summary.html，看这几项：
| 指标 | 合理范围 | 过低提示 | 过高提示 |
|---|---|---|---|
| 细胞数（Estimated Number of Cells） | 1,000 – 10,000（看上样） | 细胞死亡、上样不足 | 双细胞、进样过浓 |
| 每细胞测序深度（Mean Reads per Cell） | 20,000 – 100,000，最低 10,000 | 测序不足 | — |
| 中位基因数（Median Genes per Cell） | 500 – 5,000 | 细胞质量差、深度不足 | 双细胞 |
| 总检测基因数（Total Genes Detected） | 人/鼠 15,000 – 25,000 | 参考注释版本不匹配 | — |
| 测序饱和度（Sequencing Saturation） | 50% – 80% | 可以再加深度 | 继续测序收益递减 |
| 比对率（Reads Mapped to Genome） | > 80% | 参考版本错、样本污染 | — |
| 线粒体基因比例 | < 10% | — | 细胞破损、应激 |
饱和度的公式是 1 - unique UMIs / total reads，意思是"再测下去还能看到多少新分子"。对 PBMC 这种相对稀疏的样本，60% 左右就可用；细胞图谱级项目允许更高，但回报递减。
图 5：真实 PBMC 3k 细胞逐步纳入后累计检出的基因数。filtered matrix 不包含原始 reads，因此这里不伪造测序饱和度，而是展示可由矩阵直接计算的基因检出趋势。
图 6：PBMC 3k 矩阵中的基因检出统计。filtered matrix 不包含比对日志，因此这里展示真实可追溯的基因检出类别。
把输出读进 Seurat / Scanpy
图 7：细胞数量与基因检测关系。展示了随着细胞数量增加，检测到的基因总数的变化趋势。
图 8：UMI 计数分布。展示了每个细胞的 UMI 计数分布，蓝色虚线表示中位数。
图 9：PBMC 3k 真实细胞按 barcode 顺序分成四个子集后的 QC 对比。它用于演示分组比较图形，不代表真实多样本批次。
图 10：质量控制仪表盘。综合展示了关键质量指标和细胞质量分布的散点图。
R 端用 Seurat：
library(Seurat)
data_dir <- "sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix/"
data <- Read10X(data.dir = data_dir)
seurat_obj <- CreateSeuratObject(
counts = data,
project = "PBMC",
min.cells = 3, # 只保留至少在 3 个细胞里表达的基因
min.features = 200 # 只保留至少检测到 200 个基因的细胞
)
seurat_obj
Python 端用 Scanpy：
import scanpy as sc
adata = sc.read_10x_mtx(
'sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix/',
var_names='gene_symbols',
cache=True,
)
print(adata)
用 H5 文件更简单：
# Seurat
library(Seurat)
data <- Read10X_h5("sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5")
seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts = data)
# Scanpy
import scanpy as sc
adata = sc.read_10x_h5('sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5')
读进来之后就可以进入下一章的 QC、标准化、聚类流程。
常见坑
坑 1：参考基因组版本和测序数据物种对不上
把人样本对到 mm10 上是常见误操作，结果会是比对率不到 5%。Cell Ranger 跑前先确认 --transcriptome 路径里的物种和样本一致，特别是同时跑人/鼠 PDX 项目时。
坑 2：FASTQ 命名不符合 10x 规范
Cell Ranger 通过 {sample}_S*_L*_R*_001.fastq.gz 这个固定 pattern 自动识别文件。如果文件被重命名成 sample.R1.fq.gz 这种非标准格式，会报"no FASTQ files found"。不要重命名，或重命名前严格遵守 10x 规范。
坑 3：内存给少了被 OOM 杀掉
--localmem 默认 32 GB，对很多样本不够。看到 "Killed" 或没有 web_summary 输出，先怀疑内存。保险起见 --localmem=64，更大样本（>20k 细胞）给 128。
坑 4：直接用 raw_feature_bc_matrix 做下游
raw_* 包含所有 barcode（绝大多数是空液滴），用它做下游聚类会被噪声主导。永远用 filtered_feature_bc_matrix。raw_* 只在你自己想跑 EmptyDrops、调过滤策略时才有用。
坑 5：web_summary 里 Sequencing Saturation 100% 不一定是好事
100% 意味着继续测下去也看不到新分子 — 但更常见的原因是测序深度不够、或 UMI 长度被剪掉了导致大量 read 被判重复。80% 上下是健康范围，> 95% 应该回头检查 chemistry 设置。
下载资源
下一步
接着深入：
- 03 质量控制、聚类与细胞类型注释 — 拿到 Cell Ranger 输出后的下一步：怎么做 QC、聚类、注释。绝大多数读者直接来这里。
横向延伸：
- 01 实践数据集与数据获取 — 如果你还没搞清楚要分析哪份数据
- 04 多样本数据整合 — 多样本项目如何用
cellranger aggr合并