07 多模态数据分析
07 多模态数据分析
多模态单细胞技术在一个细胞里同时测两种信息：CITE-seq 同时测 RNA 和细胞表面蛋白，10x Multiome 同时测 RNA 和染色质可及性。相比纯 scRNA-seq，多模态数据的优势是可以相互验证和补充：RNA 层的聚类结果，往往能在蛋白层找到更清晰的 marker。
本节用 10x Genomics 的 5k PBMC CITE-seq 数据演示最常用的一条 CITE-seq 分析流程：分别标准化 RNA 和 ADT，再用 WNN（Weighted Nearest Neighbor）做联合聚类。
多模态技术对比
| 技术 | 测量内容 | 常见用途 |
|---|---|---|
| CITE-seq | RNA + 表面蛋白（ADT） | 免疫学、细胞分型 |
| ASAP-seq | RNA + 染色质开放 | 调控机制 |
| 10x Multiome | RNA + ATAC（同细胞） | 基因表达与调控联动 |
| Perturb-seq | RNA + CRISPR 扰动 | 遗传学筛选 |
CITE-seq 门槛低，直接用标准 Seurat/Scanpy 就能做；Multiome 需要走 Cell Ranger ARC 流程，后续分析借助 Signac 或 MultiVI。
CITE-seq 的 WNN 分析
数据是 01 章里介绍过的 5k PBMC CITE-seq，下载后 filtered_feature_bc_matrix/ 目录里同时包含 Gene Expression 和 Antibody Capture 两层矩阵。
先读入并分别对两层数据做标准化和降维：
library(Seurat)
# 读取 CITE-seq 数据（同时包含 RNA 和 ADT）
data_dir <- "~/biof3-data/pbmc5k-citeseq/filtered_feature_bc_matrix"
counts <- Read10X(data.dir = data_dir)
# 创建 Seurat 对象：RNA 作为主 assay，ADT 作为额外 assay
cbmc <- CreateSeuratObject(counts = counts$`Gene Expression`, project = "PBMC5K_CITE")
cbmc[["ADT"]] <- CreateAssayObject(counts = counts$`Antibody Capture`)
# RNA 标准化 + 高变基因 + PCA
DefaultAssay(cbmc) <- "RNA"
cbmc <- NormalizeData(cbmc)
cbmc <- FindVariableFeatures(cbmc)
cbmc <- ScaleData(cbmc)
cbmc <- RunPCA(cbmc)
# ADT 用 CLR 归一化（Centered Log Ratio），更适合抗体信号
DefaultAssay(cbmc) <- "ADT"
cbmc <- NormalizeData(cbmc, normalization.method = "CLR", margin = 2)
cbmc <- ScaleData(cbmc)
cbmc <- RunPCA(cbmc, reduction.name = "apca")
RNA 和 ADT 的归一化方式不同：RNA 常用 LogNormalize，ADT 用 CLR（margin = 2 意为按细胞做 CLR）。两层分别做完 PCA 后，用 WNN 把它们的邻居结构加权合并，再在合并图上聚类和降维：
# WNN：根据两个 reduction 同时找邻居
cbmc <- FindMultiModalNeighbors(
cbmc,
reduction.list = list("pca", "apca"),
dims.list = list(1:30, 1:18)
)
# 在 WNN 图上做 UMAP 和聚类
cbmc <- RunUMAP(cbmc, nn.name = "weighted.nn", reduction.name = "wnn.umap")
cbmc <- FindClusters(cbmc, graph.name = "wsnn", resolution = 0.5)
# 可视化
DimPlot(cbmc, reduction = "wnn.umap", label = TRUE)
跑完得到的 cbmc@meta.data 里会新增一列 seurat_clusters，Reductions(cbmc) 里会多出 wnn.umap。比较三张 UMAP（只用 RNA、只用 ADT、WNN 联合）通常会看到：WNN 版本在分群边界上更干净，尤其是 T 细胞内部的 CD4/CD8 亚群。
后续可做的分析
- 按蛋白 marker 重新注释聚类：PBMC 的 ADT panel 一般包含 CD3/CD4/CD8/CD19/CD14 等经典标志，比起光靠 RNA 标记，注释会更可靠。
- 找差异蛋白：
FindMarkers(cbmc, assay = "ADT", ...)可以直接在 ADT 层做差异分析。 - 与原章节对比：把这份数据的 WNN 聚类结果和 04 章里只做 RNA 的整合结果画到一起，能看到蛋白信号如何修正 RNA-only 的分群。
10x Multiome（RNA + ATAC）分析思路类似，但 ATAC 层要用 Signac，归一化方法是 TF-IDF + SVD，后面在 10 scATAC-seq 分析 里会再讲。