02 原始数据处理与 Cell Ranger
02 原始数据处理与 Cell Ranger
测序下机拿到的是一堆 FASTQ 文件，里面按 read 顺序存着每条 reads 的碱基序列和质量值。要把这些原始 reads 变成"基因 × 细胞"的表达矩阵，需要经过三件事：识别每条 read 属于哪个细胞（barcode）、去除重复分子（UMI 去重）、比对到参考基因组并数每个基因有多少条 reads。对于 10x Chromium 技术平台，把这三件事打包起来做的软件就是 Cell Ranger。
本节介绍 10x 单细胞数据的基本结构、Cell Ranger 的工作流程和典型用法，以及产出之后如何用 Seurat / Scanpy 读进来。真正做分析需要约 64 GB 内存和若干小时 CPU 时间，如果你的机器达不到，这里贴的命令可以先放一放，直接用01 章下载好的 PBMC 3k 表达矩阵继续往下走。
10x 单细胞数据的基本结构
10x Chromium 用微流控芯片把细胞和含 barcode 的凝胶珠一起包进油滴（GEM），每个 GEM 里最多一个细胞和一颗珠子。同一细胞的所有 mRNA 都会被打上相同的 cell barcode，同一 mRNA 分子经过反转录后会携带唯一的 UMI。这两个标识让"哪条 reads 来自哪个细胞、哪条 reads 来自同一分子"变得可以在下游分析里重建出来。
图 1：PBMC 3k 真实 filtered matrix 的关键统计，包括细胞数、矩阵基因数、检出基因数、中位 UMI、中位基因数和中位线粒体比例。
FASTQ 文件的组织方式
10x 的 FASTQ 常见命名是 {sample}_S1_L001_R1_001.fastq.gz 这种格式，三个角色：
R1：16 bp 的 cell barcode + 10 bp 的 UMI（v3 chemistry；v2 是 14+10）+ Poly-TR2：测到的 cDNA 序列本体I1（可选）：样本索引，多样本混合上机时区分样本
图 2：FASTQ 文件结构示意图。展示了 Read 1 和 Read 2 中各组成部分的长度和位置。
单条 FASTQ record 的内容就是 4 行格式：
@序列ID
ATCGATCGATCG...
+
IIIIIIIIIIII...
Cell Ranger 做什么
Cell Ranger 的 cellranger count 命令把一组 FASTQ 变成一份可直接读进 Seurat / Scanpy 的表达矩阵。过程大致是：识别 cell barcode 并做纠错 → 去除 UMI 重复 → 用 STAR 比对 R2 到参考基因组 → 根据比对结果给每个 (cell, gene) 累加 UMI 数 → 用 EmptyDrops 等算法判断哪些 barcode 对应的是真实细胞。输出里最重要的是 filtered_feature_bc_matrix/ 和 web_summary.html。
系统要求
Cell Ranger 8 只在 Linux 下官方支持（没有 macOS/Windows 版本）。一个常规 PBMC 样本大约要 8 核 CPU、64 GB 内存和几百 GB 磁盘；大样本或同时跑多个按比例加码。
安装 Cell Ranger
Cell Ranger 本身需要到 10x Genomics 下载页登录索取下载链接（每个链接都有时效）。拿到 URL 后：
wget -O cellranger-8.0.0.tar.gz \
"你从 10x 下载页拿到的带签名的 URL"
tar -xzvf cellranger-8.0.0.tar.gz
export PATH=/path/to/cellranger-8.0.0:$PATH
cellranger --version
参考基因组按物种下载对应版本：
# 人 GRCh38
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz
# 鼠 mm10
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2024-A.tar.gz
tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz
跑一次 cellranger count
图 3：PBMC 3k 真实矩阵的输出检查点。图中展示参考基因数、实际检出基因数、filtered cell barcode 数和按本教程阈值保留的细胞数。
一个标准调用：
cellranger count \
--id=PBMC_sample1 \
--transcriptome=/data/refdata-gex-GRCh38-2024-A \
--fastqs=/data/fastq/PBMC \
--sample=PBMC_1 \
--localcores=16 \
--localmem=128
重要参数：
| 参数 | 作用 | 备注 |
|---|---|---|
--id |
输出目录名 | 同时也是后续报告里的 sample ID |
--transcriptome |
参考基因组路径 | 必须和测序样本物种对得上 |
--fastqs |
FASTQ 所在目录 | 多 lane 用逗号分隔，如 /lane1,/lane2 |
--sample |
样本前缀 | Cell Ranger 会匹配 {sample}_S*_L*_R*_001.fastq.gz |
--localcores |
CPU 核心数 | 通常 8-16，受机器限制 |
--localmem |
内存上限（GB） | 至少 64；高 UMI 样本更多 |
--expect-cells |
预期细胞数 | 芯片说明书会给，不给默认按 EmptyDrops 自适应 |
--chemistry |
chemistry 版本 | 大多数情况下可以留 auto |
Cell Ranger 除了 count 还有 aggr（多样本合并）、reanalyze（改参数重分析）、mkref（自建参考）这几个子命令，日常最常用的还是 count。
输出目录结构
sample_01/
└── outs/
├── web_summary.html # QC 网页报告（必看）
├── metrics_summary.csv # web_summary 的数据版
├── filtered_feature_bc_matrix/ # 过滤后的表达矩阵（下游分析用）
│ ├── barcodes.tsv.gz
│ ├── features.tsv.gz
│ └── matrix.mtx.gz
├── filtered_feature_bc_matrix.h5
├── raw_feature_bc_matrix/ # 未过滤矩阵，做 EmptyDrops 调参时用
├── raw_feature_bc_matrix.h5
├── possorted_genome_bam.bam # 比对结果，可视化或 velocity 用
├── possorted_genome_bam.bam.bai
├── molecule_info.h5 # 每个 UMI 的分子级信息，aggr 要用
└── cloupe.cloupe # Loupe Browser 专用
filtered_feature_bc_matrix/ 下是典型的 10x 三件套：
barcodes.tsv.gz # 每行一个细胞 barcode
features.tsv.gz # 每行一个基因：ENSEMBL_ID symbol Gene Expression
matrix.mtx.gz # 稀疏矩阵（MatrixMarket 格式）
filtered_feature_bc_matrix.h5 是同样的信息压缩成单个 HDF5 文件，Seurat 和 Scanpy 都能直接读，对后续自动化脚本更方便。
web_summary 里看什么
图 4：质量控制指标分布。展示了基因数、UMI 数和线粒体基因比例的分布情况，红色虚线表示质量控制阈值。
跑完之后第一件事是在浏览器里打开 outs/web_summary.html，看这几项：
| 指标 | 合理范围 | 过低提示 | 过高提示 |
|---|---|---|---|
| 细胞数（Estimated Number of Cells） | 1,000 – 10,000（看上样） | 细胞死亡、上样不足 | 双细胞、进样过浓 |
| 每细胞测序深度（Mean Reads per Cell） | 20,000 – 100,000，最低 10,000 | 测序不足 | — |
| 中位基因数（Median Genes per Cell） | 500 – 5,000 | 细胞质量差、深度不足 | 双细胞 |
| 总检测基因数（Total Genes Detected） | 人/鼠 15,000 – 25,000 | 参考注释版本不匹配 | — |
| 测序饱和度（Sequencing Saturation） | 50% – 80% | 可以再加深度 | 继续测序收益递减 |
| 比对率（Reads Mapped to Genome） | > 80% | 参考版本错、样本污染 | — |
| 线粒体基因比例 | < 10% | — | 细胞破损、应激 |
饱和度的公式是 1 - unique UMIs / total reads，意思是"再测下去还能看到多少新分子"。对 PBMC 这种相对稀疏的样本，60% 左右就可用；细胞图谱级项目允许更高，但回报递减。
图 5：真实 PBMC 3k 细胞逐步纳入后累计检出的基因数。filtered matrix 不包含原始 reads，因此这里不伪造测序饱和度，而是展示可由矩阵直接计算的基因检出趋势。
图 6：PBMC 3k 矩阵中的基因检出统计。filtered matrix 不包含比对日志，因此这里展示真实可追溯的基因检出类别。
把输出读进 Seurat / Scanpy
图 7：细胞数量与基因检测关系。展示了随着细胞数量增加，检测到的基因总数的变化趋势。
图 8：UMI 计数分布。展示了每个细胞的 UMI 计数分布，蓝色虚线表示中位数。
图 9：PBMC 3k 真实细胞按 barcode 顺序分成四个子集后的 QC 对比。它用于演示分组比较图形，不代表真实多样本批次。
图 10：质量控制仪表盘。综合展示了关键质量指标和细胞质量分布的散点图。
R 端用 Seurat：
library(Seurat)
data_dir <- "sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix/"
data <- Read10X(data.dir = data_dir)
seurat_obj <- CreateSeuratObject(
counts = data,
project = "PBMC",
min.cells = 3, # 只保留至少在 3 个细胞里表达的基因
min.features = 200 # 只保留至少检测到 200 个基因的细胞
)
seurat_obj
Python 端用 Scanpy：
import scanpy as sc
adata = sc.read_10x_mtx(
'sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix/',
var_names='gene_symbols',
cache=True,
)
print(adata)
用 H5 文件更简单：
# Seurat
library(Seurat)
data <- Read10X_h5("sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5")
seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts = data)
# Scanpy
import scanpy as sc
adata = sc.read_10x_h5('sample_01/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5')
读进来之后就可以进入下一章的 QC、标准化、聚类流程。
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下一步
继续学习：03 质量控制、聚类与细胞类型注释